蚯蚓细胞色素P450基因的克隆及CYP1A2的蛋白表达特征研究

摘要

蚯蚓是土壤中生物量最大的动物类群之一，具有重要的生态功能。同时蚯蚓对于土壤中污染物的降解具有重要作用，是土壤生态毒理研究的重要指示生物。细胞色素P450酶是一类在生物体中广泛存在的代谢酶系，又称为多功能氧化酶、药物代谢酶或单加氧酶等。由于P450酶具有种类多样性和底物特异性的特点，使得这类酶能够催化多种类型的反应。细胞色素P450酶不仅参与一些内源物质的代谢，如激素、脂肪酸等，还在许多外源物质如环境污染物的代谢中起着重要作用。
　　目前关于蚯蚓生态毒理的研究主要集中于利用蚯蚓作为指示生物对土壤环境进行监测和评价，常见的可用于环境监测和评价的蚯蚓体内的生物标志物主要有金属硫蛋白、抗氧化酶、体腔细胞结构与DNA损伤等。对于蚯蚓体内的P450基因克隆和蛋白表达方面的研究很少。
　　本文通过设计引物，采用RT-PCR和RACE-PCR的技术成功从蚯蚓中提取出一条细胞色素P450基因，并对其分类地位上相似的动物P450进行进化上的比对和蛋白表达分析。然后以赤子爱胜蚓、多肉远盲蚓和威廉腔蚓为试验材料，提取这三种蚯蚓的整体组织蛋白，以及赤子爱胜蚓不同器官和不同成长阶段的组织蛋白进行提取，测定蛋白浓度，采用Western-blot免疫印迹方法检测分析了细胞色素P450酶系中的亚酶CYP1A2的蛋白表达情况。
　　实验结果表明，通过使用特异性引物成功的从蚯蚓体内克隆出一条编码P450的基因（命名为EW1）。该序列总长1004bp，编码区全长492bp，编码163个氨基酸，提交至 GenBank所得序列号：ID:KM881474。该序列含有典型的细胞色素P450保守区域，包括：血红素结合区域FXXGXXXCXG，P450蛋白活性位点螺旋I；位于螺旋C中与血红素结合有关的序列W xxx R，能够与亚铁功能区域的自由基发生作用；包含在螺旋K内的序列E xx R，是所有P450蛋白内最容易识别的序列。
　　从GenBank数据库中选取了来自10个物种的P450基因序列，结合蚯蚓的P450基因序列，利用MEGA5.0获得了进化树。对进化树进行分析表明，蚯蚓的P450序列 EW1与涡虫（Schmidtea mediterranea）P450的同缘关系最近，其次是曼氏血吸虫（Opisthorchis felineus）和日本血吸虫（Schistosoma japonicum）的P450基因，同缘关系最远的是文蛤蜊（Meretrix meretrix）。
　　应用蛋白模拟软件Phyre2对克隆到的蚯蚓P450进行同源模建，以数据库中已提交的三维结构为模板，得到蚯蚓P450序列的三维结构模型，发现与其同源性最高的为CYP45027家族，其中与人的CYP27B家族同源性最高，三维结构相似度高达97％，对比人的CYP27B的活性中心，在结构的相应位置找到了蚯蚓P450的活性中心。
　　CYP1A2蛋白表达研究结果表明不同发育时期的赤子爱胜蚓的CYP1A2蛋白表达量有显著差异（P<0.05）。其中在成体蚯蚓中的表达最高，其次是亚成体，在蚯蚓幼体中的表达最低。CYP1A2蛋白在赤子爱胜蚓的不同器官中的表达也有显著差异（P<0.05）。通过数据分析可知，在肠中的表达最高，显著高于受精囊和体壁（P<0.05），而在受精囊和体壁中有表达但是二者差异不显著（P＞0.05）。另外，在赤子爱胜蚓、威廉腔蚓和多肉远盲蚓三种不同种类蚯蚓中CYP1A2蛋白的表达有一定差异但差异不显著（P＞0.05）。
　　本论文首次克隆出了一条蚯蚓的细胞色素P450基因，同时首次鉴定出CYP1A2在蚯蚓体内的表达情况。这些结果对于进一步研究蚯蚓对污染物的代谢与解毒机理，拓展蚯蚓生态毒理学的研究范畴和研究深度具有一定的促进作用。

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第一章 绪论

1.1 蚯蚓生态毒理学

1.2 细胞色素P450酶

1.3 免疫印迹

1.4 研究内容、目的意义与创新点

第二章 蚯蚓细胞色素P450序列提取及特性分析

2.1 试验材料

2.2 试验方法

2.3 结果与分析

2.4 小结

第三章 蚯蚓P450 3’端序列的克隆及分析

3.1 试验材料

3.2 试验步骤

3.3 结果分析

3.4 小结

第四章 蚯蚓P450全长序列的分析

4.1 材料与方法

4.2 结果与分析

4.3 讨论

4.4 小结

第五章 蚯蚓CYP1A2蛋白表达差异的研究

5.1 蚯蚓不同成长阶段CYP1A2表达差异的研究

5.2 蚯蚓不同器官CYP 1A2蛋白表达差异的研究

5.3 不同蚯蚓种类CYP1A2蛋白表达差异研究

5.4 讨论

5.5 小结

第六章 结论与展望

6.1 结论

6.2 展望

参考文献

附录

致谢

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