温热疗法与口服碘化钾溶液对孢子丝菌病模型小鼠表皮朗格汉斯细胞的影响

摘要

目的:
　　 孢子丝菌病是由于感染申克氏孢子丝菌而引起的一种皮肤、皮下组织及其附近淋巴管慢性、化脓性炎症的深部真菌病。目前，碘化钾溶液仍为治疗本病的首选药物，但因部分患者对碘化钾过敏或合并有肺结核，影响了部分人群在临床上的应用。温热疗法是一种有效的替代辅助疗法，可以通过增强局部皮肤免疫促进皮损消退，适用于一些不能应用口服药的孢子丝菌病患者，如孕妇、肝肾功能受损者及药物过敏者，其临床实施方便，无创伤，痛苦小，患者易于接受。
　　 局部温热治疗的作用机制目前尚不明确。但肿瘤热疗方面及目前对感染性皮肤病的治疗研究结果均发现，温热可以增强机体的免疫功能。表皮朗格汉斯细胞(Langerhans Cell，LC)是树突状细胞家族的一员，常驻于表皮，为皮肤内主要的抗原提呈细胞。表皮朗格汉斯细胞在诱导皮肤免疫反应中发挥非常重要的作用，它们能够捕获加工皮肤中遇到的抗原，并在转移至局部引流淋巴结的过程中将其表达在MHC-Ⅰ和Ⅱ类分子中，在那里将抗原提呈给效应T细胞，从而启动适应性免疫应答，朗格汉斯细胞的迁移在皮肤免疫反应中起着关键性作用。
　　 本实验利用温热治疗设备及碘化钾溶液对感染孢子丝菌病的小鼠进行治疗，观察小鼠两种治疗后表皮内朗格汉斯细胞数量的影响，从局部免疫功能变化角度探讨热疗的作用机制。
　　 实验材料和方法:
　　 一、孢子丝菌病模型小鼠皮损周围表皮LC与正常皮肤处表皮LC的比较:
　　 1、材料
　　 申克孢子丝菌菌株(CMU14034)来自中国医科大学附属第一医院皮肤科，为局限型皮肤型孢子丝菌病患者的分离株。
　　 昆明雌性小鼠，周龄8-10周，体重20-22克，10只，于背部皮下注射菌悬液约0.1ml（浓度约1×108个/ml），建立孢子丝菌病小鼠模型，约两周出现皮损。
　　 2、方法
　　 将小鼠麻醉、背部脱毛，剪取面积为1.0×1.0cm的皮肤（感染小鼠取皮损周围未破坏皮肤及远端正常皮肤）。将剪取的皮肤放入EDTA分离液(PH=7.2)中，37℃恒温箱恒温2小时，取出皮片，在解剖显微镜下分离真表皮。采用免疫组织化学的方法染色表皮内LC。光学显微镜下观察LC，细胞膜和（或）细胞质呈棕褐色树突状细胞为LC，于20倍光镜下每张片随机选取6个非连续视野，计数方格内的阳性细胞数，计算出单位面积内细胞的密度，数据以中位数的形式表示。
　　 3、统计学处理
　　 采用SPSS17.0和Graphpad5.0软件包进行统计分析和图形制作，所有数据以中位数表示，两组间实验指标的比较采用Mann-Whitney U检验，相关性分析采用Spearman秩相关检验，P＜0.05为有统计学意义。
　　 二、温热疗法、碘化钾溶液治疗孢子丝菌病模型小鼠LC的比较
　　 1、材料
　　 申克孢子丝菌菌株(CMU14034)来自中国医科大学附属第一医院皮肤科，为局限型皮肤型孢子丝菌病患者的分离株。
　　 昆明雌性小鼠，周龄8-10周，体重20-22克，30只，于背部皮下注射菌悬液约0.1ml（浓度约1×108个/ml），建立孢子丝菌病小鼠模型，约两周待出现皮损后随机分为对照组、碘化钾组和热疗组，每组10只。
　　 2、方法
　　 热疗组接种两周后采用远红外局部温热治疗仪局部加热小鼠皮损，温度41-43℃，20分钟/次，隔日一次，皮损恢复正常后停止。碘化钾组给予10％碘化钾溶液，给药方式:碘化钾溶液根据小鼠平均每日饮水量（4-6ml/只）配制成0.24％水溶液代替饮用水（相当于人体用量的30ml/天）。对照组接种后不予任何处置。治疗开始即观察治疗反应，如，皮损大小变化;炎症反应强度。治疗后皮损消退即进行表皮朗格汉斯细胞计数（计数方法同上）并做皮损真菌培养，真菌培养阴性作为治疗有效;同时比较两种治疗方法皮损消退所需治疗时间。
　　 3、统计学处理
　　 所得数据用应用SPSS17.0和Graphpad5.0软件包进行统计分析和图形制作，所有数据以中位数表示，两组间实验指标的比较采用Mann-Whitney U检验相关性分析采用Spearman秩相关检验，P＜0.05为有统计学意义。
　　 结果:
　　 一、孢子丝菌病模型小鼠皮损周围表皮LC与正常皮肤处表皮LC的比较:
　　 孢子丝菌病模型小鼠正常表皮内朗格汉斯细胞分布较均匀，有较多的树突，孢子丝菌病皮损周围表皮内朗格汉斯细胞变圆、变小，树突数量减少甚至消失、长度变短。孢子丝菌病皮损周围表皮内朗格汉斯细胞数目较正常表皮内朗格汉斯细胞分布密度明显下降，有显著性差异(P=0.0005)。
　　 二、温热疗法与碘化钾溶液治疗孢子丝菌病模型小鼠疗效表皮LC的比较:
　　 1、温热疗法与碘化钾溶液治疗孢子丝菌病模型小鼠治疗时间的比较:
　　 接种后一周左右出现皮损。第二周、第三周皮损最为显著，主要变现为接种处红肿、结节、溃疡、溢脓及结痂。伴随着治疗次数增加，热疗组及碘化钾组小鼠皮损处红肿消退、溃疡愈合及痂皮脱落均较对照组快，且温热组小鼠皮损干燥结痂较碘化钾小鼠时间短。治疗结束后热疗组小鼠接种处活检真菌培养9只为阴性，1只为阳性;碘化钾组小鼠治疗结束后皮损活检真菌培养结果7只为阴性，3只为阳性;对照组接种后四十天真菌培养9只均为阳性，1只为阴性。
　　 2、温热疗法与碘化钾溶液治疗孢子丝菌病模型小鼠表皮LC数量的比较:
　　 温热组小鼠皮损周围表皮内LC密度较感染组明显下降(P＜0.001)，碘化钾组小鼠皮损周围表皮内LC密度较感染组无显著差异(P=0.3256)，温热组小鼠皮损周围表皮内LC密度下降较碘化钾组小鼠更为明显，差异有统计学意义(P=0.0002)。
　　 结论:
　　 通过我们的研究观察，得出以下结论:
　　 孢子丝菌病小鼠模型有自愈倾向。
　　 孢子丝菌感染可以影响表皮内LC从而调动皮肤的免疫功能，感染孢子丝菌病的小鼠表皮内LC密度较正常表皮内LC密度明显下降。
　　 温热疗法治疗孢子丝菌病模型小鼠有效，小鼠表皮受到温热刺激作用后，表皮内LC数量下降，LC形态发生改变;口服碘化钾溶液治疗后孢子丝菌病模型小鼠皮损周围表皮内LC密度及形态无明显变化。

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