白喉毒素截短体DT270-326对血肿瘤屏障通透性的影响及作用机制研究

摘要

目的：
　　脑胶质瘤是最常见的中枢神经系统原发肿瘤，其侵袭性强，预后差。血肿瘤屏障(blood-tumor barrier, BTB)是脑胶质微血管内皮细胞(glioma microvascularendothelial cells，GECs)形成的屏障，虽然BTB在组成上不同于正常血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)，但仍是限制抗肿瘤药物转运的主要因素，如何使BTB可逆性的开放，有效地增加肿瘤组织中化疗药物的浓度，是提高化疗疗效的关键。
　　外源性物质通过BTB主要经由两条途径:跨细胞途径和细胞旁途径。跨细胞途径主要与受体介导的跨细胞转运和caveolae依赖性的胞吞转运有关。在对白喉毒素(DT)的无毒突变体CRM197的研究中，发现CRM197能够以caveolae依赖性的方式增加BTB的通透性，但机制尚不明确。
　　DT是白喉棒状杆菌合成的细菌外毒素。DT有三个结构域，此三个结构域彼此独立，体外的DT突变体、截短体仍能保持各区的生物学活性。目前关于DT的研究主要集中于R区和C区，对T区转位过膜的机制仍未阐明。而T区有可能参与了CRM197通过caveolae依赖性的跨细胞途径增加BTB通透性的过程。
　　Caveolae是一种特化的细胞质膜结构，其主要功能是转运大分子物质进出细胞，同时caveolae中还存在着数目惊人的膜结合蛋白，caveolae为这些信号分子提供了一个发挥作用的平台。在胶质瘤微血管内皮细胞中，caveolin-1是形成caveolae所必需的主要结构蛋白通过控制信号分子的活性和定位调节囊泡的分裂、内吞、融合和胞吐，在调节囊泡运输中起重要作用。在这一过程中，caveolin-1在14位酪氨酸(Y14)上的磷酸化是caveolae结构和功能形成的必要条件，也是caveolae信号级联过程中的一个中间步骤。
　　锌指转录因子Egr-1(early growth responsive gene-1，Egr-1)为即刻早期反应基因家族中最为重要的一员。作为一种核转录因子，Egr-1的转录调控活性受到自身磷酸化水平的影响。磷酸化的Egr-1与靶基因的结合减弱，而非磷酸化的Egr-1则能够结合靶基因的启动子区，调控靶基因的转录。目前已证实，多种因素都可以改变Egr-1的磷酸化水平，进而影响其转录活性，而Egr-1至少参与了30多种基因的转录调控。
　　在本研究中，我们应用hCMEC/D3细胞，成功建立体外BTB模型;合成DT截短体——DT270-326，研究DT270-326对BTB通透性的影响以及对胶质瘤微血管内皮细胞的跨细胞转运的影响，并初步明确其可能的分子机制，旨在为神经胶质瘤等中枢神经系统疾病的治疗提供新途径。
　　方法：
　　1、体外BTB模型的建立和DT270-326、DT270-326突变体的制备。
　　2、建立Cav1wt、Cav1Y14F、Cav1Y14D过表达的稳定转染细胞系。
　　3、应用辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)渗出量评估体外BTB模型的通透性变化。
　　4、应用透射电镜观察DT270-326对脑微血管内皮细胞超微结构的影响。
　　5、应用免疫荧光法检测DT270-326作用不同时间后，胶质瘤微血管内皮细胞中DT270-326和caveolin-1的分布和表达水平的变化;以及DT270-326和caveolin-1在胶质瘤微血管内皮细胞中是否存在共定位。
　　6、免疫共沉淀法检测DT270-326和caveolin-1在胶质瘤微血管内皮细胞中是否存在相互作用。
　　7、应用RT-PCR法和Western blot法检测DT270-326作用前后，GECs细胞中caveolin-1 mRNA和蛋白表达水平的变化。
　　8、Western blot法检测在DT270-326作用不同时间点及使用Src抑制剂PP2后，胶质瘤微血管内皮细胞中p-Src、Src、p-caveolin-1、caveolin-1、p-Egr-1的蛋白表达水平。
　　9、应用CCK-8检测与DT270-326联合应用后，阿霉素对U87细胞活性(CCK-8)的变化。
　　10、应用流式细胞术检测与DT270-326联用后，阿霉素对U87细胞凋亡变化。
　　11、采用SPSS13.0统计学处理软件，实验数据采用(x)±s表示，多组间采用单因素方差分析和LSD检验，P＜0.05为差异有统计学意义，P＜0.01为有非常显著的统计学差异
　　结果：
　　1、成功建立Cav1wt、Cav1Y14F、Cav1Y14D过表达的稳定转染细胞系。
　　2、成功建立了体外BTB模型，公司合成DT270-326和它的三种点突变体。
　　3、DT270-326能够以剂量依赖的方式增加BTB的通透性，其中5μM DT270-326为开放血脑屏障的最适剂量。DT270-326以时间依赖的方式增加BTB的通透性，其中DT270-326作用6h时，增加BTB的通透性的效果最显著。
　　4、DT270-326能够增加胶质瘤微血管内皮细胞中吞饮小泡的数量;DT270-326通过caveolae依赖性的跨细胞途径增加BTB的通透性。
　　5、荧光共聚焦显微镜下观察，DT270-326和caveolin-1在胶质瘤微血管内皮细胞的胞浆中表达。DT270-326增强caveolin-1在胶质瘤微血管内皮细胞中的表达，并存在共定位。
　　讨论：
　　本研究发现，5μM DT270-326能显著增加HRP通过BTB的转运效率，并且在作用6h时达峰值，而此时胶质瘤微血管内皮细胞中吞饮小泡数量也出现明显增多;应用caveolin-1的抑制剂filipinⅢ预处理后，可以抑制胶质瘤微血管内皮细胞对HRP的转运。初步推测DT270-326经由caveolae介导的跨细胞转运增加BTB的通透性。进一步发现，DT270-326与caveolin-1存在共定位及相互作用;在DT270-326作用1h时，胶质瘤微血管内皮细胞中Src，caveolin-1和Egr-1的磷酸化水平显著升高;呈现先逐渐升高后逐渐降低的趋势，峰值出现在6h; Caveolin-1的mRNA和蛋白表达变化与Egr-1的磷酸化变化趋势一致。
　　本研究结果显示，DT270-326能够以时间依赖和剂量依赖的方式增加BTB的通透性，5μM的DT270-326作用6h BTB的通透性达到峰值。此时的胶质瘤微血管内皮细胞中包含HRP的吞饮小泡数量明显增多。Caveolae从细胞质膜的释放是内皮细胞内吞的重要模式，是通过跨细胞转运增加BTB通透性的主要途径。进一步应用caveolin抑制剂filipinⅢ预处理后，HRP的通过率显著下降，提示DT270-326可能是经由caveolae介导的胞吞转运来增加BTB的通透性。
　　阿霉素是临床常用的治疗肿瘤的药物。本研究中，与单独应用阿霉素相比，DT270-326与阿霉素联用显著增加了transwell下室中U87细胞的凋亡率，降低了细胞活力，提示DT270-326能够促进阿霉素有效通过BTB，增加抗肿瘤效应。
　　综合本研究结果，DT270-326通过其caveolin-结合基序与caveolin-1的互作;DT270-326作用后Src水平磷酸化增加，通过增加caveolin-1的磷酸化，上调了Egr-1的磷酸化水平，进而促进caveolin-1的mRNA和蛋白的表达，通过caveolae依赖的跨细胞途径增加BTB的通透性。本研究结果提示DT270-326可能促进大分子化疗药物通过BTB，该项研究有可能为中枢神经系统疾病的药物转运治疗提供新途径。
　　结论：
　　1、DT270-326以剂量依赖和时间依赖的方式增加BTB的通透性，5μM DT270-326为开放BTB的最适剂量，DT270-326作用6h时，增加BTB的通透性的效果最显著。
　　2、DT270-326通过caveolae依赖性的跨细胞途径增加BTB通透性。
　　3、DT270-326与caveolin-1共定位，通过caveolin-1结合基序与caveolin-1相互作用。
　　4、DT270-326增加人脑胶质瘤微血管内皮细胞中Src、caveolin-1以及Egr-1的磷酸化水平，从而促进caveolin-1的mRNA和蛋白的表达。
　　5、DT270-326能够促进阿霉素通过BTB，显著降低胶质瘤细胞活力，增加细胞凋亡率。

目录

声明

摘要

英文缩略语

前言

材料与方法

一、实验材料

二、实验方法

实验结果

一、DT270-326增加BTB的通透性

二、BTB超微结构改变

三、DT270-326增强caveolin-1在胶质瘤微血管内皮细胞中的表达，两者在细胞中共定位

四、DT270-326与caveolin-1存在相互作用

五、DT270-326上调胶质瘤微血管内皮细胞中caveolin-1 mRNA和蛋白的表达水平

六、DT270-326上调内皮细胞中Src、caveolin-1、Egr-1的磷酸化水平

七、PP2显著抑制DT270-326作用后内皮细胞中Src、caveolin-1和Egr-1的磷酸化水平以及caveolin-1的蛋白表达水平

八、Caveolin-1 Y14磷酸化上调caveolin-1的表达

九、DT270-326在体外BTB中促进阿霉素的跨膜转运

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 白喉毒素跨膜域调节血肿瘤屏障通透性的研究进展

致谢

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