MicroRNA-34c对血肿瘤屏障通透性和胶质瘤微血管内皮细胞生物学行为的影响及作用机制研究

摘要

MicroRNA(miRNAs)是一类长度约22～24个核苷酸的内源性单链非编码微小RNA。miRNAs能特异性地识别其下游靶基因信使RNA(mRNA)的3'非翻译区(3'untranslated regions，3'UTR)，并与之互补结合，使mRNA降解或抑制mRNA的翻译，多在基因的转录后水平上起调控作用，在细胞发育、分化、增殖、凋亡等过程中发挥重要作用。
　　MicroRNA-34(miR-34)是一类进化高度保守的miRNA家族，通过参与多种细胞的增殖，存活，凋亡，迁移，侵袭和血管生成等，在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用。在脊椎动物基因组内，miR-34家族有三个成员:miR-34a，miR-34b和miR-34c。据报道，miR-34a在神经胶质瘤中低表达，是潜在的抑癌基因。上调miR-34a的表达能够诱导细胞周期阻滞或凋亡，发挥抑制神经胶质瘤的作用。最近的报道指出，miR-34c在胶质瘤患者的脑组织和胶质瘤细胞系中表达下调，过表达miR-34c能显著抑制神经胶质瘤细胞U251和U87的增殖，因此，我们推测miR-34c可能在胶质瘤的发生发展过程中发挥了与miR-34a相似的作用。但是miR-34c在胶质瘤微血管内皮细胞中的表达水平及其发挥的作用目前尚不清楚。此外，有报道称miR-34a通过抑制沉默信息调节子1(silent information regulator1，SIRT1)诱导内皮祖细胞衰老，并阻碍其血管生成;过表达miR-34a诱导人脐静脉内皮细胞衰老并抑制其细胞增殖。这些研究表明miR-34a可能参与内皮细胞的功能调控。据检索，关于miR-34c是否参与血肿瘤屏障(blood-tumor barrier，BTB)的通透性以及胶质瘤微血管内皮细胞(glioma microvascular endothelial cells，GECs)的生物学行为的调控，目前尚未见报道。
　　Myc的相关锌指蛋白(myc-associatedzinc-finger protein，MAZ)是一个含有丰富脯氨酸、丙氨酸重复和6个C2H2型锌指模序，以及5个能被酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点的转录因子，其基因是位于人染色体16p11.2的单拷贝基因，转录产物为2.7 kb的mRNA，编码分子量为60 kD的MAZ蛋白。已有的研究结果表明，MAZ在启动和终止靶基因转录的过程中发挥着双重作用。MAZ基因的异常表达与肿瘤的发生和发展密切相关。Smits等报道MAZ在胶质母细胞瘤患者的脑血管中表达升高，miR-125b诱导的MAZ下调能在体外抑制人脑血管内皮细胞迁移和血管生成，这表明MAZ能够参与调节血管内皮功能。但是，MAZ是否参与miR-34c对胶质瘤微血管内皮功能的调节还未见报道。
　　在本研究中，我们应用miR-34c过表达和表达沉默质粒稳定转染的hCMEC/D3细胞，成功建立体外BTB模型;研究miR-34c表达变化对BTB通透性的影响以及对胶质瘤微血管内皮细胞的生物学行为的影响，并初步明确其可能的分子机制，为神经胶质瘤等中枢神经系统疾病的治疗提供新途径。
　　方法:
　　1、人脑微血管内皮细胞系hCMEC/D3细胞，人神经胶质瘤细胞系U87细胞和人胚肾细胞系HEK293T细胞的培养。
　　2、miR-34c和MAZ过表达或表达沉默稳定转染细胞系的建立。
　　3、体外BTB模型的建立。
　　4、应用实时荧光定量PCR检测miR-34c在胶质瘤微血管内皮细胞中的内源性表达水平。
　　5、应用跨内皮电阻(transendothelial electric resistance，TEER)和辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)渗出量评估体外BTB模型的通透性变化。
　　6、应用RT-PCR、Westeern blot和免疫荧光法检测胶质瘤微血管内皮细胞中MAZ、紧密连接相关蛋白ZO-1和occludin的mRNA以及蛋白表达水平变化。
　　7、应用双荧光素酶报告基因分析miR-34c和MAZ的直接作用。
　　8、应用染色质免疫共沉淀分析MAZ与紧密连接相关蛋白ZO-1和occludin的直接作用。
　　9、应用MTS法检测胶质瘤微血管内皮细胞的增殖能力变化。
　　10、应用流式细胞仪检测胶质瘤微血管内皮细胞的凋亡变化。
　　11、应用划痕实验和Transwell迁移实验检测胶质瘤微血管内皮细胞的迁移能力变化。
　　12、应用小管形成实验检测胶质瘤微血管内皮细胞的血管生成能力变化。
　　结果:
　　1、成功建立miR-34c和MAZ过表达或表达沉默的稳定转染细胞系。
　　2、成功建立体外BTB模型，获得胶质瘤微血管内皮细胞。
　　3、miR-34c在胶质瘤微血管内皮细胞中的表达较正常脑微血管内皮细胞(endothelial cells，ECs)显著升高。
　　4、miR-34c过表达显著增加BTB的通透性，miR-34c表达沉默显著降低BTB的通透性。
　　5、miR-34c过表达显著下调紧密连接相关蛋白ZO-1和occludin的分布和表达;miR-34c表达沉默显著上调ZO-1和occludin的分布和表达。
　　6、MAZ是miR-34c的靶基因。
　　7、miR-34c过表达显著下调MAZ的分布和表达;miR-34c表达沉默显著上调MAZ的分布和表达。
　　8、miR-34c和MAZ反向共同调节BTB的通透性。
　　9、miR-34c和MAZ反向共同调节紧密连接相关蛋白ZO-1和occludin的表达水平。
　　10、胶质瘤微血管内皮细胞中MAZ与紧密连接相关蛋白ZO-1和occludin的启动子直接结合。
　　11、miR-34c过表达抑制胶质瘤微血管内皮细胞的增殖;miR-34c表达沉默促进其增殖。
　　12、miR-34c过表达促进胶质瘤微血管内皮细胞的凋亡;miR-34c表达沉默抑制其凋亡。
　　13、miR-34c过表达抑制胶质瘤微血管内皮细胞的迁移;miR-34c表达沉默促进其迁移
　　14、miR-34c过表达抑制胶质瘤微血管内皮细胞的血管生成;miR-34c表达沉默促进其血管生成。
　　讨论:
　　我们的研究证明，在胶质瘤微血管内皮细胞中miR-34c的表达水平显著高于在正常脑微血管内皮细胞中的表达。许多研究表明miR-34c参与多种人类恶性肿瘤的发生和发展。大多数报道表明，miR-34c在前列腺癌、胃癌、肺癌、乳腺癌等癌症中表达下调，因此miR-34c被认为是候选的抑癌基因。然而，Yamazaki等发现miR-34c在多种人黑色素瘤细胞系中差异表达:在A375细胞系中低表达，而在G361和SK-MEL-24细胞系中高表达。此外，与正常组织相比，miR-34c在未分化型胃癌组织中显著上调。miR-34c在不同肿瘤细胞以及不同组织中呈现不同的表达水平，在不同的微环境下，miR-34c在不同的肿瘤发生发展中可能起不同的作用。然而，miR-34c是否参与调节胶质瘤微血管内皮细胞功能并进一步调节BTB通透性仍不清楚。
　　为探讨miR-34c对BTB功能的影响，我们建立了miR-34过表达或表达沉默的稳定转染细胞，成功建立了体外BTB模型。分别应用TEER和HRP渗出量检测BTB的通透性。结果显示，miR-34c过表达导致BTB的通透性增加;而miR-34c表达沉默对BTB起相反的调节作用。紧密连接在血脑屏障的形成和维持中发挥重要作用。ZO-1定位于胞浆膜表面，occludin是整合膜蛋白，二者都是紧密连接的重要组成部分。在本研究中，RT-PCR和Western blot检测结果显示miR-34c过表达显著下调ZO-1和occludin的mRNA和蛋白表达;相反，miR-34c的表达沉默诱导ZO-1和occludin表达上调。免疫荧光染色的结果与RT-PCR和Western blot检测结果相一致。目前，我们已经证明了miR-34c通过调节ZO-1和occludin的表达改变BTB的通透性。
　　然而，miR-34c调节BTB通透性的可能机制仍不清楚。据我们所知，miR-34c通过降解mRNA和抑制翻译介导基因沉默。一些癌基因或调节因子，例如c-myc、bcl-2和SIRT1，被认为是miR-34c的靶基因。作为一种转录因子，MAZ被认为是一些miRNA的可能的下游靶点。据报道，miR-125b的过表达可诱导MAZ表达下调，进而抑制VEGF介导的血管生成。我们应用生物信息学软件TargetScan预测到在MAZ mRNA的3'UTR有一个潜在的miR-34c结合位点。双荧光素酶报告基因检测结果显示MAZ是miR-34c的靶基因。此外，miR-34c过表达能够下调MAZ的mRNA和蛋白表达，而miR-34c沉默则上调其表达。其他研究者的研究结果也支持我们的观点。比如，在前列腺癌和乳腺癌中miR-34c的表达下调，而MAZ的表达上调。为了更好地研究miR-34c与MAZ的作用关系，我们在hCMEC/D3细胞中同时过表达或表达沉默miR-34c或MAZ，然后建立体外BTB模型。结果显示，miR-34c和MAZ反向共同调节BTB的通透性和紧密连接相关蛋白ZO-1和occludin的表达。这进一步说明了miR-34c通过靶定MAZ，介导紧密连接相关蛋白ZO-1和occludin的表达，进而调节BTB的通透性。我们进一步的染色质免疫共沉淀结果表明，在胶质瘤微血管内皮细胞中，MAZ可以与ZO-1启动子区第二个潜在结合位点(GGGCGGG)以及occludin启动子区第一个潜在结合位点(CCCTCCC)相结合。转录因子不仅可以通过控制转录速率来调节基因转录产物(mRNA和蛋白质)的数量，而且可以调节转录因子本身。最近的一项研究显示，MAZ与胎儿Alz-50克隆1(fetal Alz-50 clone1，FAC1)相互作用改变了MAZ的转录能力。MAZ蛋白能抑制MAZ基因的表达，被MAZ抑制的eNOS基因的表达参与调节MAZ基因的自我抑制。然而，MAZ与紧密连接相关蛋白ZO-1和occludin的直接结合能否调节MAZ的转录活性还需进一步探索。
　　胶质瘤细胞的侵袭性生长是多因素参与、多步骤完成的复杂过程，主要依赖于肿瘤血管的发生与生长。胶质瘤血管内皮细胞在这一过程中发挥着至关重要的作用。我们进一步研究了miR-34c对胶质瘤微血管内皮细胞生物学行为的影响，结果表明，miR-34c抑制胶质瘤微血管内皮细胞的增殖，促进胶质瘤微血管内皮细胞的凋亡，抑制胶质瘤微血管内皮细胞的迁移和血管生成。肿瘤血管是肿瘤形成、生长及转移的基础，因此”以肿瘤血管内皮细胞为靶点的抗肿瘤血管治疗是肿瘤治疗的重要策略之一。
　　本研究证明了miR-34c可能是BTB通透性和胶质瘤微血管内皮细胞生物学行为的重要调节子。miR-34c通过靶定MAZ，介导紧密连接相关蛋白ZO-1和occludin的表达，进而调节BTB的通透性;miR-34c促进胶质瘤微血管内皮细胞的凋亡，抑制胶质瘤微血管内皮细胞的增殖、迁移和血管生成。由此我们认为miR-34c可能是胶质瘤治疗的潜在靶点，为胶质瘤等中枢神经系统肿瘤的治疗提供新的策略。
　　结论:
　　1、miR-34c在胶质瘤微血管内皮细胞中的表达较正常脑微血管内皮细胞明显升高。
　　2、MAZ是miR-34c的靶基因，miR-34c在转录后水平上调节MAZ基因的表达。
　　3、胶质瘤微血管内皮细胞中MAZ与紧密连接相关蛋白ZO-1和occludin的启动子直接结合。
　　4、miR-34c通过靶定MAZ，介导紧密连接相关蛋白ZO-1和occludin的表达，进而调节BTB的通透性。
　　5、miR-34c过表达抑制胶质瘤微血管内皮细胞增殖、迁移和血管生成，诱导胶质瘤微血管内皮细胞凋亡。miR-34c表达沉默产生的结果与之相反。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 MicroRNA-34c对血肿瘤屏障通透性的影响及作用机制研究

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

论文二 MicroRNA-34c对胶质瘤微血管内皮细胞生物学行为的影响

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 miRNA-34家族与神经胶质瘤的研究进展

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致谢

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