MicroRNa-34c在人脑胶质瘤中的表达及其对胶质瘤细胞生物学特性的影响和机制研究

摘要

神经胶质瘤是始发于颅内的最常见恶性肿瘤，占所有恶性中枢神经系统肿瘤的78％，占颅内原发肿瘤的40％。当今世界胶质瘤的治疗仍然是神经外科领域最棘手的问题之一，目前，针对胶质瘤尚无有效的筛查或早期诊断方法，确诊时往往已为晚期，尽管近几十年来以手术为主的治疗手段有很大的进展，但是胶质瘤的生长速度快、边界不清、术后容易复发等特点都使胶质瘤的治疗效果难以令人满意，其预后尚不乐观，其中多形性胶质母细胞瘤的中位生存期仅为12-15个月，因此在手术切除肿瘤的同时必须寻找新的治疗方法辅助治疗才能使胶质瘤的治疗产生本质的进步。近年来，有关神经胶质瘤的诊断和治疗的研究已深入到了分子水平，涉及到胶质瘤发生，发展，尤其是演变过程的基因有多种。因此寻找与胶质瘤发生相关的致病基因，从基因水平上进行针对性防治可能成为有效治疗胶质瘤的根本途径。
　　 miRNAs是一类长约22个核苷酸的内源性非编码单链小RNAs，通过与靶mRNA3'非编码区完全或非完全互补的结合而导致靶mRNA的降解或翻译过程的抑制，进而调控基因的表达，miRNAs能参与一系列重要的生物学行为，例如细胞分化、细胞增殖与凋亡、应激反应等，同时有报道miRNAs与人类癌症的发生、发展有密切关系，在肿瘤的发生过程中起到调控的枢纽作用，因此已经有专家预测，把miRNA作为肿瘤生物治疗的靶分子将比编码分子作为靶分子更加有效。miRNA将成为肿瘤生物治疗领域的一个新亮点，可能会给肿瘤的药物设计和进行针对性治疗提供一个新的平台。
　　 已有文献报道miR-34参与p53和Notch信号通路的调控，具有肿瘤抑制的特性。在哺乳动物中，miR-34家族包括3类:miR-34a具有自己的转录本，而miR-34b和miR-34c则共享一个转录本。有报道称在胰腺癌、骨肉瘤、乳腺癌和非小细胞肺癌中miR-34a低表达或检测不到。亦有报道miR-34a在肺癌、乳腺癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌和黑色素瘤的细胞系中处于失活状态。有人报道在恶性黑色素瘤、结肠直肠癌、口腔鳞状细胞癌中，由于CGP岛甲基化表现为miR-34b/c的失活。并且，miR-34a的低表达和非小细胞肺癌的高复发率相关，表明miR-34a能够作为对非小细胞肺癌判断预后的新的靶标。到目前为止，所有已发表的数据表明在恶性肿瘤中miR-34的失活是常有的事。但miR-34c作为miR-34家族中的一员，在胶质瘤中的表达及对肿瘤发生、发展起到的具体作用还未见报道。
　　 本实验应用定量PCR方法对18例脑胶质瘤标本和5例脑组织标本分别进行miR-34c-3p和miR-34c-5p含量的检测，研究miR-34c-3p和miR-34c-5p在人类脑胶质瘤中的表达及临床意义。并应用LipofectamineTM RNAiMAX对人脑胶质瘤细胞株U251和U87进行转染，采用多种方法对转染后的胶质瘤细胞株的转染效率、细胞增殖、细胞迁移、细胞侵袭、细胞周期、细胞凋亡等生物学特性进行检测，而后应用数据库检索miR-34c-3p和miR-34c-5p可能的下游靶基因，找到感兴趣的共同调控的靶基因Notch2，并采用westenblot实验方法及荧光素酶报告基因技术进行直接验证，探索miRNA-34c是否对靶基因Notch2有直接调控关系，进一步阐明作用机理，期望为胶质瘤的基因治疗找到有效可行的治疗靶点并为临床应用提供理论依据，为肿瘤的治疗提供一个新思路。本实验共分三个部分。
　　 第一部分miRNA-34c在人脑胶质瘤中的表达研究
　　 目的:探讨miRNA-34c在人脑胶质瘤组织中的表达情况。
　　 方法:应用定量PCR方法对18例WHO分级Ⅱ-Ⅳ级的福尔马林固定石蜡包埋的脑胶质瘤标本和外伤或脑出血患者内减压手术获得的5例脑组织标本分别进行miR-34c-3p和miR-34c-5p含量的检测，比较不同级别胶质瘤和正常脑组织中miR-34c-3p和miR-34c-5p的表达差异，分析miR-34c-3p和miR-34c-5p的表达和胶质瘤恶性程度的相关性。
　　 结果:与正常脑组织相比，胶质瘤中miR-34c-3p和miR-34c-5p的表达皆显著减少，而且miR-34c-3p和miR-34c-5p的表达随着胶质瘤级别或恶性程度的增加分别减少，呈显著的负相关（miR-34c-3p的spearman相关系数=-0.856，P＜0.001; miR-34c-5p的spearman相关系数=-0.767，P＜0.01)。
　　 结论:MiR-34c在人脑胶质瘤细胞中的表达显著降低，而且表达随着肿瘤分级或恶性程度的增高而减少，与胶质瘤级别的升高呈显著的负相关。MiR-34c在胶质瘤的进展中有重要的意义，可作为脑胶质瘤临床分级的重要指标。
　　 第二部分上调miR-34c抑制胶质瘤细胞的增殖及侵袭
　　 目的:研究miR-34c对人脑胶质瘤细胞株U251和U87的增殖、迁移、侵袭、凋亡和细胞周期的影响。
　　 方法:应用脂质体将miR-34c导入胶质瘤细胞株U251和U87后，应用定量PCR验证转染效果，应用MTS法检测细胞增殖变化、Transwell小室检测细胞迁移侵袭能力变化、流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期的改变。
　　 结果:在U87和U251细胞系中，miR-34c-3p和miR-34c-5p的表达量要明显小于正常胶质细胞系HEB。而转染了miR-34c-3p的U87和U251细胞，其miR-34c-3p的表达量明显高于未转染组的细胞(Normal组，P＜0.05)和NC组细胞(P＜0.05)，miR-34c-5p也呈同样的变化。在U251细胞中，转染miR-34c-3p或miR-34c-5p后48、72、96小时，细胞存活率显著低于Normal组(P＜0.05)和NC组(P＜0.05)。而在U87细胞中情况有所不同，转染miR-34c-3p后48、72、96小时，细胞存活率显著低于Normal组(P＜0.05)和NC组(P＜0.05);转染miR-34c-5p后24、48、72、96小时，细胞存活率显著低于Normal组(P＜0.05)，而与NC组没有显著差异(P＞0.05)。利用Transwell小室，U251细胞转染miR-34c-3p或miR-34c-5p后，其迁移至下室的细胞数量与Normal组和NC组相比显著减少，在U87细胞中的情况相同。U251细胞高表达miR-34c-3p或miR-34c-5p，U87细胞高表达miR-34c-3p可以导致细胞停滞在S期，同时降低了G0/G1期的细胞数。在U251细胞中，凋亡细胞在Normal组和NC组分别占6.57％和6.3％，而转染miR-34c-3p或miR-34c-5p后凋亡细胞所占比例上升分别占28.49％和28.14％。但是在U87细胞中有所不同，仅转染miR-34c-3p后凋亡细胞数上升(3.56％)，而Normal组，NC组和转染miR-34c-5p组分别为1.53％，1.68％和1.91％。
　　 结论:转染上调miR-34c在胶质瘤中的表达能够抑制其增殖、迁移和侵袭能力，导致细胞周期在S期及G2/M期的停滞，诱导胶质瘤细胞的凋亡，为脑胶质瘤靶向治疗提供可靠的依据。但miR-34c-3p与miR34c-5p在不同细胞系中，影响细胞增殖能力、细胞周期变化及诱导细胞凋亡的效果有所不同，推测他们可能是通过不同靶点或机制起作用。
　　 第三部分MiR-34c在胶质瘤细胞中的靶基因及作用机制
　　 目的:探讨miR-34c在胶质瘤细胞中作用的下游靶基因及作用机制
　　 方法:通过miRanda、PICTAR、TargetScan三个数据库筛选miR-34c的预测靶点，从中找到我们感兴趣的基因，再利用定量PCR和Western技术检测转染后的胶质瘤细胞该基因的表达情况，最后利用荧光素酶报告基因实验验证该感兴趣基因确实为miR-34c的下游靶基因。
　　 结果:通过多种数据库的筛选，我们最终将感兴趣的基因锁定在Notch2。定量PCR的结果显示，转染miR-34c-3p后的Notch2 mRNA的表达量相比Normal组和NC组显著降低(P＜0.05)，但转染miR-34c-5p后却没有明显变化。Western blot的结果同样显示，U251和U87细胞转染miR-34c-3p后的Notch2的表达量相比Normal组和NC组降低了15％。而转染miR-34c-5p后Notch2的表达量没有显著变化。在转染克隆有Notch2基因3'UTR质粒的实验中，miR-34c-3p组与空白组和NC组相比，荧光素酶活性显著降低(P＜0.05)，证明miR-34c-3p能与Notch2基因3'UTR结合，从而抑制荧光素酶的活性。miR-34c-3p Inhibitor组与空白组和NCInhibitor组相比，荧光素酶活性显著升高(P＜0.05)，证明miR-34c-3pInhibitor能封闭内源miR-34c-3p，抑制miR-34c-3p的作用。在转染克隆有mut Notch2-2基因3'UTR质粒的实验中，miR-34c-3p组与空白组和NC组均无差异，证明miR-34c-3p不能与mut Notch2-2基因3'UTR结合，抑制荧光素酶的活性，突变完全。在转染克隆有Notch2基因3'UTR质粒的实验中，miR-34c-5p组与空白组和NC组均无差异，证明miR-34c-5p不能与Notch2基因3'UTR结合，抑制荧光素酶的活性。同时在转染克隆有mut Notch2-1基因3'UTR质粒的实验中，miR-34c-5p组与空白组和NC组均无差异，证明miR-34c-5p不能与mut Notch2-1基因3'UTR结合，抑制荧光素酶的活性。
　　 结论:转染了miR-34c-3p的胶质瘤细胞其Notch2表达量明显降低，而转染miR-34c-5p的没有显著变化。利用荧光素酶报告载体策略，验证了Notch2确为miR-34c-3p的下游靶基因，但不是miR-34c-5p的下游靶基因。

目录

声明

摘要

英文缩写

引言

第一部分 miR-34c在人脑胶质瘤中的表达研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分 上调miR-34c对胶质瘤细胞生物学特性影响的研究

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第三部分 MiR-34c在胶质瘤细胞中的靶基因及作用机制

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述一 MicroRNA在肿瘤发生发展中与Notch信号通路的关系

综述二 MicroRNA和肿瘤

致谢

个人简历