沉默小鼠脑微血管内皮细胞中氨转运体基因表达的小干扰RNA序列的筛选

摘要

目的:肝性脑病是肝功能障碍或门体分流异常导致的一种神经精神系统疾病，是肝功能衰竭、肝硬化以及肝癌等多种肝脏疾病的常见并发症。肝性脑病严重影响着患者的生存率以及其生存质量。目前围绕肝性脑病其发病机制的研究已经广泛展开，也存在着各种不同关于HE的理论与学说，其中氨中毒学说是目前肝性脑病发病机制众多学说中的核心学说。该学说认为人体内氨的产生增多，但是氨的清除却不能够相应的增加甚至出现减少，进而导致人体氧化应激激活、谷氨酰胺增多，从而引起脑星型胶质细胞的水肿，此为肝性脑病的病理基础。现阶段已有研究发现，氨在细胞膜内外的转运可以依靠一种特殊的载体蛋白，这种载体蛋白即氨转运蛋白。本实验的目的在于通过基因沉默的方法，使用小干扰RNA沉默氨转运蛋白基因，抑制氨转运体蛋白的表达，从而抑制氨在细胞内外的转运。然后通过实验方法筛选出具有高效沉默效率的小干扰RNA序列，目的是为肝性脑病运用基因沉默方法进行治疗的下一步的动物实验与药物治疗做基础研究。
　　研究方法:培养原代小鼠脑微血管内皮细胞进行细胞实验，而后运用阳离子脂质体转染细胞的方法将小干扰RNA转染进小鼠脑微血管内皮细胞中，转染完成后，继续细胞培养一段时间，待细胞培养结束提取转染后细胞里的总蛋白以及总RNA，然后运用蛋白免疫印迹WesternBlot以及RT-PCR、核酸琼脂糖凝胶电泳的方法观察细胞内氨转运蛋白及其mRNA的表达情况，以此判断小干扰RNA对细胞Rhcg基因的沉默效果以及沉默效率，筛选出能够高效抑制小鼠脑微血管内皮细胞中氨转运体基因的小干扰RNA序列。
　　结果:比较蛋白免疫印迹WesternBlot中目的蛋白与内参蛋白的灰度比值，以及核酸琼脂糖凝胶电泳中目的基因与内参基因的灰度比值。三组小干扰RNA目的蛋白与内参蛋白的灰度比值及以及目的基因及内参基因核酸的灰度比值的组间P＞0.05，而蛋白灰度比值的结果，三组序列分别与阴性对照组、生理盐水对照组的P＜0.05，琼脂糖凝胶电泳核酸灰度比值的结果，序列455与阴性对照组、生理盐水组的P＜0.05，而其他两组序列与阴性对照组、生理盐水对照组的P＞0.05。
　　结论:三个小干扰RNA序列对小鼠脑微血管内皮细胞中的氨转运体都有沉默其表达的效果，沉默效率均在50％以上，三个序列之间无明显差别。而小干扰RNA序列455可能具有明显的沉默效率，建议筛选出小干扰RNA序列455，用以沉默小鼠脑微血管内皮细胞中氨转运体的表达。

目录

声明

摘要

英文缩略语

1 前言

2 材料和方法

2．1．2 实验试剂

2．1．3 实验溶液

2．1．4 实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 实验分组

2．2．2 转染

2．2．3 提取细胞的总蛋白以及总RNA

2．2．4 蛋白浓度测定

2．2．5 WB蛋白质免疫印迹实验

2．2．6 琼脂糖凝胶电泳

2．3 统计学分析

2．3．1 WB结果

2．3．2 琼脂糖凝胶电泳结果

3 结论

4 讨论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 氨转运蛋白与肝性脑病的研究进展以及基因沉默

攻读学位期间取得的成就

致谢

个人简历