乙型肝炎病毒X蛋白反式调节基因11剪切体的克隆表达和功能研究

摘要

研究背景与目的：我国是乙型肝炎与肝癌的高发区。乙型肝炎病毒（HBV）X基因及其编码的多功能蛋白HBx是乙型肝炎病毒基因转录的必须因子，与乙型肝炎和肝细胞癌的发生关系十分密切。本研究通过寡核苷酸基因芯片技术和生物信息学分析确定了HBxAg反式激活作用的新型靶基因，即乙型肝炎病毒X蛋白反式调节基因11（XTP11）。本研究在探讨XTP11的生物学功能过程中，发现XTP11的剪切体；通过生物信息学分析、亚细胞定位、原核表达几个方面初步阐释该基因剪切体在HBV发病过程中的生物学作用。 方法： （1）根据XTP11的全长编码基因，设计克隆扩增得到XTP11剪切体，对剪切体进行生物信息学分析。 （2）构建重组绿色荧光表达载体pEGFP-C1-XTP11剪切体，转染人肝母细胞瘤细胞系HepG2，转染24hr后在荧光倒置显微镜下观察。 （3）构建重组的原核表达载体pET-32a（+）-XTP11剪切体转化BL21宿主菌后，重组蛋白经IPTG诱导，获得了带有组氨酸（His-）标签的重组融合蛋白的优化表达，并用SDS-PAGE和Western blot对表达蛋白的特异性进行分析和验证；利用Ni+亲和柱纯化表达蛋白。 结果： （1）利用NCBI数据库中BLASTn比对分析XTP11基因，根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列，电子拼接推定该基因的开放读码框架，获得相应的XTP11剪切体全长编码基因。在NCBI中登陆获取基因库登录号（FJ211061）。研究发现XTP11剪切体（1314bp）比XTP11（1344bp）少了GGGDFGGGDF 10个氨基酸残基，其余序列相同。 （2）HepG2细胞浆出现均匀绿色荧光信号，提示XTP11剪切体主要定位于细胞浆内。 （3）XTP11剪切体融合蛋白在原核表达系统成功表达。SDS-PAGE分析表明其以包涵体形式存在，Western blot检测目的基因表达蛋白的特异性，成功获得了融合蛋白纯品。 结论：本研究利用ProtParam软件的分析，发现了XTP11剪切体蛋白的不稳定系数、疏水性指数和总平均亲水性。该蛋白主要有转角和折叠组成，较少涉及螺旋和无规卷曲。该蛋白质疏水性值的变化范围为：-0.322-2.267； Signa1P3.0-信号肽预测工具分析锚定蛋白概率为0.195，提示该蛋白为非分泌蛋白。亚细胞定位证实XTP11剪切体基因定位于肝细胞浆内。本研究成功利用大肠杆菌原核表达系统对基因进行了诱导表达，融合蛋白通过亲和层析技术进行了纯化。这些结果为阐明XTP11剪切体在HBV发病过程中的作用提供重要信息，为下一步免疫动物制备多克隆抗体，应用于免疫组织化学和酶联免疫吸附法的检测奠定了实验基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

综述:HBxAg的反式激活作用对肝细胞信号转导通路的影响

前言

第一部分XTP11剪切体的克隆化与生物信息学分析

第二部分XTP11剪切体的亚细胞定位

第三部分XTP11剪切体重组蛋白的诱导表达及纯化

结论

参考文献

附录

致谢