乙型肝炎病毒前S1蛋白反式调节基因2的功能研究

摘要

乙型肝炎病毒(HBV)属嗜肝DNA病毒，它是导致肝炎、肝硬化和肝细胞癌的主要原因。HBV感染致肝细胞损伤机制，很大程度上与病毒蛋白和肝细胞蛋白间的相互作用相关。因此，研究HBV的抗原成分与肝细胞内的蛋白相互作用及其机制，在一定程度上能够阐明HBV的致病机制，为寻找有效的防治HBV的方法提供理论依据。 本课题组成员应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization，SsH)技术，对于HBV前-S1蛋白反式激活作用的靶基因进行筛选，发现了前-S1蛋白可上调一未知功能基因的表达，命名为前-S1蛋白反式激活基因2(PS1TP2)，我们将其成功克隆，并应用生物信息学初步探讨其结构及功能。 为研究PS1TP2在HBV感染后病毒致病过程中的作用，从人肝癌细胞中得到PS1TP2基因的全长编码序列，构建与绿色荧光蛋白融合的表达载体pEGFP-C1-PS1TP2，通过基因与荧光蛋白基因融合表达，明确它的亚细胞定位主要在细胞浆。进一步应用酵母双杂交(yeast two-hybrid)技术筛选PS1TP2与白细胞文库中的结合蛋白，包括一些与细胞免疫、信号转导、能量代谢、转录调节相关的基因。将该基因克隆至原核表达载体pET32a(+)上，构建原核表达重组质粒，转化大肠杆菌Rosetta诱导进行融合表达。结果在大肠杆菌中获得了高效表达的融合蛋白，表达蛋白以包涵体形式存在。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示该蛋白的分子量约为41kD，这与预测的PS1TP2融合蛋白大小相吻合，并且通过Western-blotting检测证实了PS1TP2的表达。 我们以分子生物学技术构建PS1TP2的真核表达载体pcDNA3.1(-).PS1TP2，以表达质粒pcDNA3.1(-)-PS1TP2转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照，制备转染后的细胞裂解液。应用抑制性消减杂交(SSH)技术，构建PS1TP2激活相关基因差异表达的cDNA消减文库，筛选相关的靶基因片段，将产物与T/A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增，随机挑选克隆，多聚酶链反应(PCR)扩增后进行测序及同源性分析。筛选到的cDNA全长序列，包括一些与细胞生长调节、细胞内信号转导、肿瘤及物质代谢密切相关的蛋白编码基因，推测PSlT'P2在体内可能存在的调控机制的线索。 对该基因功能进行的初步了解，为下一步更加具体的生物学功能、基因表达调控的深入研究开辟道路。

目录

声明

前言

实验技术概述

第一章PS1TP2的克隆化及生物信息学分析

1.1材料与方法

1.2结果

1.3讨论

第二章应用酵母双杂交技术筛选白细胞cDNA文库与PS1TP2结合蛋白基因

2.1 PS1TP2蛋白酵母双杂交“饵”载体的构建及酵母蛋白表达

2.2酵母双杂交技术筛选白细胞文库中PS1TP2蛋白的结合蛋白

第三章PS1TP2蛋白的反式调节作用的研究

3.1材料与方法

3.2结果

3.3讨论

第四章PS1TP2蛋白在大肠杆菌中的表达

4.1材料与方法

4.2结果

3.3讨论

第五章PS1TP2的亚细胞定位

5.1材料与方法

5.2结果

4.3讨论

小结与展望

参考文献

相关综述

个人简历

致谢