微流控芯片三维细胞培养模式下肺癌细胞侵袭性伪足形成及转移研究

摘要

目的:肺癌是我国最常见也是死亡率最高的恶性肿瘤之一，严重危害着人类的健康。尽管原发性肿瘤在治疗方面已经取得很大进步，复发和转移是肺癌患者死亡的重要原因。细胞突起的延伸是癌细胞侵袭和转移的第一步。细胞边缘的激动蛋白促使这些突起的形成。在侵袭过程中，侵袭性细胞利用一种称作侵袭性伪足的亚细胞结构穿过基底膜，这种亚细胞结构具有破坏细胞基质的活性。微流控芯片，以其集成度高、成本低、体积小、灵敏度高、试剂消耗少、检测时间短等优势，被公认为是本世纪一项重要的科学技术。其微通道尺寸和多维网络形成的相对封闭的环境与细胞空间特征相似，尤其适合细胞培养，加之可以持续供给细胞营养物质，能较好地模拟体内肿瘤微环境。本实验目的在于利用微流控芯片技术，构建一个适于进行三维细胞培养的肿瘤侵袭检测平台，并进行肿瘤侵袭性检测，研究EGF（表皮生长因子）及GM6001（基质金属蛋白酶抑制剂）对肺癌侵袭的影响。
　　 方法:本实验利用微流控芯片系统进行肺癌侵袭性研究，该系统装置包括1个芯片和4个MS26型微注射器。通过向细胞池内灌注细胞悬液凝胶混合物的方法构建三维培养体系，并通过微注射器为细胞培养持续提供新鲜培养基。将芯片放入培养箱内培养1小时后，借助微注射器将(EGF，200ng/ml)和(GM6001，10μM)通过微通道作用于实验组细胞12小时。用免疫荧光的方法检验各组细胞F-肌动蛋白和皮层肌动蛋白表达量，用两种蛋白表达的共同区域来表示侵袭性伪足的形成，同时观察其形态变化。
　　 结果:本实验成功地设计和构建了一个适于进行三维细胞培养的微流控芯片侵袭检测平台，并能实现一个对照组和两个实验组细胞间的平行对照实验。免疫荧光检测显示，在对照组中，只有23.4％的A549细胞形成侵袭性伪足，每个细胞平均只有1.8个侵袭性伪足形成;在EGF组中，EGF刺激能够显著的诱导侵袭性伪足的形成，形成侵袭性伪足的细胞数占64％，每个细胞平均有5.8个伪足形成。在GM6001/EGF组中，GM6001能够中和EGF的诱导作用，并且能够使侵袭性伪足的形成水平降低至对照组的水平甚至更低，仅仅有17％的细胞形成侵袭性伪足，平均每个细胞有1.3个伪足形成。从形态上看，侵袭性伪足能够被EGF诱导，并且这种诱导作用可以被GM6001抑制。
　　 结论:本实验建立了一个适于肿瘤细胞三维培养的微流控芯片侵袭检测平台，能够同时平行的完成一个对照组和两个实验组细胞的培养，为细胞生物学研究及抗侵袭性伪足治疗提供一个新平台。MMPs抑制剂为抗肿瘤侵袭治疗提供了一个新的靶点，即抗侵袭性伪足治疗。该微流控芯片平台对于探讨侵袭性伪足的形成及其生物学活性具有重要的意义。本研究为肿瘤侵袭性机制的分析和发现抗侵袭的药物提供了一个简单、切实可行的平台。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1．实验材料

1．1 细胞系

1．2 主要试剂及配置

1．3 主要仪器

2．实验流程

3．实验方法

3．1 微流控芯片的设计、制作及处理

3．2 细胞的培养、传代、冻存和复苏

3．3 芯片细胞培养

3．4 细胞诱导处理

3．5 芯片检测F-激动蛋白、皮层肌动蛋白的表达——免疫荧光细胞化学

3．6 侵袭性伪足形成的检测

3．7 图像及统计学分析

结果

1．微流控芯片的构建及效能验证

2．微流控芯片的细胞培养

3．微流控芯片的侵袭检测

讨论

结论

参考文献

综述

附图

攻读学位期间发表文章情况

致谢