产菊粉酶耐热细菌的筛选及酶学性质研究

摘要

随着人们保健意识的提高，菊粉成为国内外关注的焦点，科学家们为了获得更高更纯的低聚果糖和高果糖浆，把研究的重点放在菊粉酶以及产菊粉酶的微生物上，这也是本文的目的所在。 本文介绍了以菊粉为唯一碳源，50℃高温培养，从不同土壤样品中筛选出两株产菊粉酶的高温细菌，通过对其16S rDNA基因测序及Genbank数据库比对分析，发现两株细菌16S rDNA基因序列与Bacillus smithii的同源性高达99％，分别命名为Bacillus smithiiT4和Bacillus smithiiT7，Genbank登录号分别为EU652724和EU628681。 通过对不同碳源、不同氮源、不同金属离子、不同表面活性剂、不同培养温度、不同培养基初始pH值，不同转数以及不同培养时间对菊粉酶产量的影响研究及分析，优化得到的Bacillus smithii T4菊粉酶发酵条件为的：培养基组成，菊粉3.0％(w/v)，(NH4)H2PO40.5％(w/v)，酵母提取物0.5％(w/v)，CaCl20.5mM，Brij-35,0.006％(w/v)，pH 5.5；装液量50ml/250ml三角瓶，接种量6％(v/v)，转速150rpm；50℃下培养72h，菊粉酶活力可达到134.4 IU/ml，为优化前的2.2倍。Bacillus smithii T7的菊粉酶发酵优化条件为：培养基组成菊粉2.0％(w/v)，(NH4)H2PO40.5％(w/v)，酵母提取物0.5％(w/v)，MgCl20.5mM，Brij-35,0.006％(w/v)，pH 7.0；装液量50ml/250ml三角瓶，接种量6％(v/v)，转速200rpm；50℃下培养72h，菊粉酶活力可达到136.5 IU/ml，为优化前的2.7倍。 在优化的发酵条件下，Bacillus smithii T7 72h发酵液在10000rpm，4℃下离心15min，收集上清得到粗酶液，通过10kD截留超滤浓缩，硫酸铵沉淀，10kD截留透析，DEAE-SepharoseCL-6B离子交换柱，Superdex 75凝胶过滤得到纯化的菊粉酶，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测为单一组分，亚基分子量为47kD。 水解菊粉产物经薄层层析(TLC)检测表明该酶为内切型菊粉酶；酶学性质研究表明，Bacillus smithii T7所产内切菊粉酶在70℃，pH4.5时酶活达到最高；在pH4.5-6.5时，酶的稳定性较好，在70℃，80℃的半衰期分别为9h和2.5h；Fe2+可显著提高内切菊粉酶的酶活，而Cu2+，Ba2+，K+和Na+抑制了菊粉酶活力。酶动力学分析表明菊粉是其良好的天然底物，Km值为4.17mmol/L，Vmax为833IU/mg protein。 综上所述，筛选得到的Bacillus smithii T7高温细菌，可产生热稳定的、特异性较强的内切型菊粉酶，在菊芋产品应用及开发方面，具有良好的应用前景。

目录

文摘

英文文摘

声明

引言

1文献综述

1.1菊粉

1.1.1菊粉的性质

1.1.2菊粉的营养与生理功能

1.1.3菊粉的来源

1.1.4菊粉的深加工

1.2菊粉酶

1.2.1菊粉酶的分类

1.2.2菊粉酶的性质

1.2.3菊粉酶的来源

1.2.4菊粉酶的纯化方法

1.2.5产菊粉酶的微生物及发酵条件研究现状

1.2.6菊粉酶酶性质研究现状

1.2.7菊粉酶的应用

1.3立题背景及意义

1.3.1国外菊粉酶研究情况

1.3.2我国菊粉业的发展情况

1.3.3菊粉及低聚果糖的研究意义

1.3.4研究目的

1.4本课题的研究内容

2产菊粉酶耐热细菌的分离，筛选及鉴定

2.1引言

2.2材料和方法

2.2.1实验材料和试剂

2.2.2实验仪器

2.2.3主要实验方法

2.3结果与讨论

2.3.1初筛结果

2.3.2 16S rDNA扩增和测序

2.3.3 Bacillus smithii T4和T7的系统发育分析

2.3.4细菌生理生化实验结果

2.4本章小结

3 Bacillus smithii T4和T7产菊粉酶发酵条件优化

3.1引言

3.2材料和方法

3.2.1实验材料和试剂

3.2.2主要实验仪器

3.2.3主要实验方法

3.3结果与讨论

3.3.1碳源对Bacillus smithii T4和Bacillus smithii T7产菊粉酶的影响

3.3.2不同氮源的影响

3.3.3不同金属离子对菊粉酶产量的影响

3.3.4不同的表面活性剂对菊粉酶产量的影响

3.3.5不同的初始pH对菊粉酶产量的影响

3.3.6培养温度对菊粉酶产量的影响

3.3.7菌龄和接种量对菊粉产量的影响

3.3.8转数的影响

3.3.9不同培养时间对菊粉酶产量及生物量的影响

3.4本章小结

4 Bacillus smithii T7所产菊粉酶的分离纯化

4.1引言

4.2材料与方法

4.2.1实验材料与试剂

4.2.2实验仪器

4.2.3主要实验方法

4.3结果与讨论

4.3.1(NH4)2SO4分级沉淀

4.3.2透析

4.3.3 DEAE-Sepharose CL-6B离子交换色谱

4.3.4 Superdex 75凝胶过滤色谱

4.3.5纯化结果

4.3.6酶组分纯度鉴定与分子量测定

4.4本章小结

5 Bacillus smithii T7所产菊粉酶的酶学性质

5.1引言

5.2材料与方法

5.2.1菊粉酶

5.2.2实验设备

5.2.3主要实验方法

5.3结果与讨论

5.3.1水解产物的分析

5.3.2温度对酶活大小的影响

5.3.3 pH对菊粉酶的影响

5.3.4菊粉酶动力学常数的测定

5.3.5金属离子和其它化学物质对菊粉酶的影响

5.4本章小结

6结论与展望

6.1结论

6.2展望

创新点

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致谢