氧化还原电位对酵母细胞胁迫响应的影响

摘要

继第一代以玉米为代表的粮食作物、第1.5代以木薯为代表非粮作物后，以农林业废弃物为代表的木质纤维素成为第二代燃料乙醇的新型原料，具有储存量大、产能高和不受时令限制等优点。但酵母细胞利用纤维素生产乙醇过程中面临着多种环境胁迫，包括水解液中弱酸、呋喃衍生物和酚类等抑制物，以及不利的发酵环境如高温、高渗透、低pH等多重压力，导致细胞生长、葡萄糖利用和乙醇生成受到了抑制。本工作使用氧化还原电位(Oxidoreduction Potential，ORP)调控乙醇发酵过程，考察了发酵液中氧化还原环境改变对细胞胁迫响应的影响，并着重对酵母细胞高浓度乙醇发酵(Very highgravity，VHG)进行了深入的代谢组学分析。结论如下:
　　(1)采用添加氧化还原试剂的方法调控发酵液ORP，在弱酸、呋喃衍生物和酚类物质抑制物存在的情况下，氧化态可以提升生物量，进而改善发酵结果。除苯酚外，氧化环境有利于提高乙醇收率。同时，添加氧化还原剂后，细胞代谢流向做出调整，甘油合成基本都受到了促进。ORP控制有利于脱除抑制物，对三种抑制物脱毒大小为乙酸＞糠醛＞苯酚。氧化还原剂的加入可能会与抑制物发生化学作用，但更多的是促进酵母细胞自身代谢去除抑制物。
　　(2)三种不同的胁迫条件下，即高温、高糖浓度、高乙醇浓度，添加氧化剂的氧化态均能促进细胞的生长。推测可能是由于氧化剂的添加激活了细胞的抗氧化通路，诱导相应蛋白的大量表达，使细胞能更好地应对胁迫条件。
　　(3)采用通入无菌空气的方式对ORP进行调控，ORP曲线可以反映出酵母细胞生长和乙醇生产情况。高浓度乙醇发酵中ORP控制在-150 mV时，发酵效率最好。聚类分析发现四种发酵条件的差异与溶液中的溶氧量有直接关系。主成分分析(PCA)表明-150mV时，细胞产生了更多种类的显著差异物质。在乙醇胁迫下糖代谢中间物、氨基酸、还原力等都会大量积累，但ORP为-150 mV时积累量减少，表明此条件下细胞面临乙醇胁迫较小。
　　(4)使用Logistic模型分析更细致地考察了乙酸毒性及脱毒原理。通过分析参数最大环境容纳量K值、半数生长时间tB0.5和tE0.5能够直观的反映出细胞在乙酸胁迫下的生长和发酵能力。结果表明，对于乙酸这种代谢中常见的抑制物，细胞完全可以在合适的氧化还原条件下，通过自身的能力将其代谢，解除毒性。
　　本文研究表明ORP调控能够有效提高细胞耐受外界胁迫的能力，为下一步ORP在纤维素乙醇工业技术上的应用奠定理论基础，具有可行的现实意义。

目录

声明

摘要

引言

1 绪论

1．1 纤维素燃料乙醇研究进展

1．1．1 纤维素乙醇产业发展现状

1．1．2 纤维素乙醇生产技术

1．2 酵母细胞纤维素乙醇发酵面临的挑战及解决方案

1．2．1 木质纤维素水解液抑制物

1．2．2 环境压力

1．3 氧化还原电位在微生物发酵中的应用

1．3．1 氧化还原电位概述

1．3．2 氧化还原调控微生物代谢机理及控制策略

1．3．3 氧化还原电位的应用

1．4 代谢组学在微生物中的应用

1．4．1 微生物代谢组学

1．4．2 代谢组学技术平台

1．5 研究目的与意义

2 ORP对细胞耐受木质纤维素水解液毒性副产物的影响

2．1 引言

2．2 材料和方法

2．2．1 主要实验仪器

2．2．2 主要实验试剂

2．2．3 菌株和发酵

2．2．4 ORP控制方式

2．2．5 组分分析

2．3 结果与讨论

2．3．1 氧化还原试剂的添加对酵母细胞发酵的影响

2．3．2 抑制物添加对细胞生长和发酵的影响

2．3．3 ORP对细胞耐受乙酸的影响

2．3．4 ORP对细胞耐受糠醛的影响

2．3．5 ORP对细胞耐受苯酚的影响

2．3．6 ORP控制对抑制物的脱毒作用

2．4 本章小结

3 ORP对细胞耐受环境胁迫的影响

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．3 结果与讨论

3．3．1 ORP对细胞耐受高温胁迫的影响

3．3．2 ORP对细胞耐受高糖胁迫的影响

3．3．3 ORP对细胞耐受乙醇胁迫的影响

3．3．4 ORP调控与细胞耐受性之间的相关性

3．4 本章小结

4 氧化还原电位调控高浓度乙醇发酵的代谢组学研究

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 菌种、试剂和仪器

4．2．2 ORP的测定

4．2．3 发酵与样品采样

4．2．4 主要组分分析

4．2．5 代谢组样本制备步骤

4．2．6 数据处理过程

4．3 结果与讨论

4．3．1 不同发酵条件下ORP变化特点

4．3．2 ORP调控下酵母高浓度乙醇批次发酵产物分析

4．3．3 ORP对高浓度乙醇发酵性能的影响

4．3．4 代谢图谱分析

4．4 本章小结

5 基于活性细胞的乙酸原位脱毒策略的开发

5．1 引言

5．2 材料与方法

5．3 结果与讨论

5．3．1 乙酸对细胞生长的影晌

5．3．2 提高生物量细胞对脱除乙酸的影响

5．3．3 提高细胞活性对细胞脱除乙酸的影响

5．3．4 细胞原位脱除乙酸

5．4 本章小结

结论

展望

参考文献

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致谢