酵母细胞自絮凝提高抑制物胁迫耐受性初探

摘要

纤维素乙醇是可再生新型清洁能源，可缓解石油短缺和降低环境污染。纤维素乙醇生产原料预处理过程会释放有机酸和呋喃类等抑制物，严重影响了酵母生长和乙醇发酵。因此选育具有多种抑制物耐受性且乙醇发酵性能优良的菌株对于纤维素乙醇高效生产具有重要意义。本课题组初步研究发现酵母细胞自絮凝可提高抑制物耐受性，为探究酵母细胞自絮凝提高抑制物耐受性机制，以絮凝酵母SPSC01敲除絮凝基因FLO1获得的菌株SPSC01-△FLO1为对照，在抑制物胁迫下对SPSC01进行转录组检测和分析。 前期研究发现SPSC01在糠醛香草酸胁迫下2-脱氧-6-磷酸葡萄糖磷酸酶基因DOG1、甘露糖蛋白基因TIR1和磷脂合成蛋白基因YOL032W表达量明显上调。构建了过表达菌株4126-DOG1、4126-TIR1和S288C-YOL032W，探究这3个基因与酵母抑制物耐受性的关系。结果表明，与4126-HO相比，4g/L5-HMF和5g/L香草酸胁迫下4126-DOG1和4126-TIR1发酵时间缩短了12h以上。在模拟水解液乙醇发酵过程中乙醇产率分别比4126-HO提高了41.9%和97.3%。与S288C-HO相比，S288C-YOL032W在3g/L糠醛和2g/L香草醛胁迫下菌体浓度分别提高了66.5%和42.9%，乙醇产率分别提高了167.9%和82.9%。表明过表达DOG1、TIR1和YOL032W能够显著提高酵母对5-HMF/糠醛和香草酸的耐受性。 为探究分子水平和过程工程水平调控酵母细胞自絮凝与抑制物耐受性关系，运用不同强弱启动子调控FLO1基因表达，获得了不同絮凝性状的重组菌株：6525PTDH3-FLO1＞6525PPGK1-FLO1＞6525PRPL4A-FLO1（不添加抑制物）。5-HMF、乙酸和AFP（Acetic acid,furfural and phonel）胁迫下6525PTDH3-FLO1生物量最高，其他抑制物胁迫下6525PPGK1-FLO1生物量最高，而6525PRPL4A-FLO1生长及乙醇生成最低。苯酚、糠醛和5-HMF胁迫对不同絮凝菌株乙醇生成存在不同程度的抑制作用。表明絮凝粒度越大的重组絮凝菌株抑制物耐受性和乙醇发酵性能越强。实际水解液不同转速调控重组菌株发酵结果显示，不同转速对6525-PTDH3-FLO1与6525-PPGK1-FLO1的影响不明显，6525PRPL4A-FLO1发酵性能随转速增加而降低；同一转速下6525PPGK1-FLO1和6525PTDH3-FLO1菌株的生物量和乙醇产量无明显差异，6525PRPL4A-FLO1的生物量和乙醇产量最低。相对于转速调控，不同启动子调控FLO1对絮凝酵母乙醇发酵和抑制物耐受性影响更大。 不同絮凝重组菌株AFP转录组结果分析发现，强絮凝菌株中谷氨酰胺通透酶基因GNP1和NADH脱氢酶基因NDE1表达显著上调，实验以SPSC01为宿主，构建并获得了过表达菌株SPSC01-GNP1和SPSC01-NDE1。结果显示，两重组菌株对苯酚耐受性提高最为显著，二者生物量比SPSC01-HO提高了40%以上。New-AFP混合胁迫下乙醇产率分别比SPSC01-HO提高了32.0%和26.7%。表明过表达GNP1和NDE1使SPSC01获得乙酸、糠醛和苯酚耐受性和优良的乙醇发酵性能。

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摘 要

引 言

1.1 纤维素乙醇生产概述

1.1.1 纤维素乙醇发展现状

1.1.2 纤维素乙醇生产过程

1.2 抑制物胁迫对纤维素乙醇发酵的影响

图1.2 木质纤维素预处理水解液主要副产物组成[27]

Fig.1.2 Average composition of lignocellulosic bi

1.2.1 有机酸对酵母生长和乙醇发酵的影响

1.2.2 呋喃类对酵母生长和乙醇发酵的影响

1.2.3? 醛类对酵母生长和乙醇发酵的影响

1.3 絮凝酵母及其抑制物耐受性研究

1.3.1 自絮凝酵母絮凝机制

2.4.3.4 重组菌株S288C-YOL032W在不同抑制物胁迫下乙醇发酵性能比较

3 不同启动子及转速调控酵母絮凝与抑制物耐受性研究

3.1 引言

3.2 实验材料与仪器

结 论

附录 本论文涉及的基因序列

致 谢

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