重组几丁质酶水解黑曲霉菌丝体生产N-乙酰葡萄糖胺

摘要

N-乙酰葡萄糖胺是一种具有多种生物活性的单糖，广泛应用于食品、药品及化妆品行业。酶法降解几丁质生产N-乙酰葡萄糖胺因其工艺条件温和，绿色环保，具有很好的发展前景。黑曲霉菌丝体作为发酵工业废弃物是一种廉价且具有安全性的几丁质原料，因此针对黑曲霉菌丝体进行酶法生产N-乙酰葡萄糖胺工艺的探索具有较高的研究与应用价值。本文以酶法水解黑曲霉菌丝体为出发点，克隆表达并表征了一种来自黑曲霉的几丁质酶AnChi，并对AnChi在生产中的应用进行了探索。 本论文包括以下研究内容： (1)通过序列比对与同源模建分析对AnChi的功能进行预测，发现其具有高度保守的GH18家族几丁质酶结构，推测其具有几丁质酶活性，而且底物亲和力较低。 (2)构建了大肠杆菌表达质粒pET-28a-AnChi并成功转化至大肠杆菌BL21(DE3)，使用IPTG诱导表达得到C端含有组氨酸标签的AnChi，通过金属螯合层析分离纯化，得到高纯度的AnChi，表达量可达到40 mg/L。 (3)对AnChi的酶学性质进行表征，测得最适温度40℃，最适pH为6.0，同时测得其对4-MU-β-(GlcNAc)2与乙二醇几丁质的底物动力学参数。通过水解实验，评估了AnChi对固体底物的水解能力，评价了不同几丁质酶对黑曲霉菌丝体的水解能力，发现AnChi对于水解菌丝体具有优势。 (4)构建了枯草芽孢杆菌表达质粒pDG1663-AnChi并成功转化至枯草芽孢杆菌K07，通过组成型表达得到AnChi，使用离子交换层析进行初步分离，通过活性和SDS-PAGE对表达进行验证。 (5)使用重组枯草芽孢杆菌的发酵液水解黑曲霉菌丝体，产物通过HPLC分析鉴定为几丁二糖，浓度达到3.8 mmol/L，转化率达到78%。在反应中加入微量的OfHexl，所得产物为GlcNAc。 (6)对AnChi的重复利用进行了探索，使用黑曲霉菌丝体吸附发酵液中的AnChi，其吸附效果不明显。

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