一种N-乙酰葡萄糖胺异构酶在生产N-乙酰甘露糖胺中的应用

摘要

本发明公开了一种氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的N-乙酰葡萄糖胺异构酶在催化合成N-乙酰甘露糖胺中的应用。即以氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的N-乙酰葡萄糖胺异构酶为催化剂，以N-乙酰葡萄糖胺为底物，制备N-乙酰甘露糖胺。本发明首次将氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的N-乙酰葡萄糖胺异构酶应用于N-乙酰甘露糖胺制备中，取得很好的效果。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种N-乙酰葡萄糖胺异构酶(N-acetylglucosamine  2-epimerase，AGE)的应用，尤其涉及一种来自海藻Prochlorococcus marinus str.MIT 9215中的N-乙酰葡萄糖胺异构酶（PmAGE）在以N-乙酰葡萄糖胺 （N-acetyl-D-glucosamine，GlcNAc）为底物生产N-乙酰甘露糖胺 （N-acetyl-D-mannosamine,ManNAc）中的应用。

背景技术

N-乙酰甘露糖胺（N-acetyl-D-mannosamine,ManNAc）是一种重要的中间体，可用 于抗流感药物前体及婴幼儿奶粉添加剂N-乙酰神经氨酸（N-acetyl-D-neuraminic acid, Neu5Ac）的合成。

以N-乙酰葡萄糖胺（N-acetyl-D-glucosamine，GlcNAc）为底物用于合成ManNAc， 再以ManNAc和丙酮酸为底物经N-乙酰神经氨酸缩合酶（N-acetylneuraminic acid lyase, Nal）催化合成N-乙酰神经氨酸是目前最主要的合成Neu5Ac的途径。而把廉价的底物 GlcNAc经异构反应生成其昂贵的同分异构体ManNAc是两步反应中的关键步骤。

迄今为止关于催化GlcNAc合成ManNAc的反应已有许多报道。概括起来主要有化 学法和生物催化法。

化学催化法是在强碱性的条件下将GlcNAc异构成ManNAc，但是该方法对下游的 底物及酶具有强烈的降解作用，因而不适合大规模应用[1]。

生物催化法采用AGE在温和的条件下催化GlaNAc生成ManNAc，因而避免了化 学法中强碱对下游反应的抑制作用。但是AGE只存在在自然界极少的几个物种中。目 前报道的AGE主要集中在哺乳动物，如猪[2]、人[3]、老鼠[4]；以及淡水藻，如 Synechocystis sp.PCC6803[5]和Anabaena sp.CH1[6]中；以及卵形拟杆菌Bacteroides  ovatus ATCC8483[7]中。这些AGE的共同的特点是需要ATP作为激活剂。全细胞催化 法可以克服反应体系中添加ATP的需要[8]，但其缺陷是细胞膜降低了底物的传质造成 反应速率降低，而且全细胞催化剂无法长期稳定地重复利用。与此相反，通过酶的固定 化方式进行ManNAc生产可以克服底物的传质作用而且酶可以长期重复利用，但是却需 要添加高成本的ATP[9]。本专利中研究的AGE可以在不需要添加ATP的情况下表现出 很高的酶活，从而很好地解决了酶催化法合成ManNAc中的瓶颈。

本专利中涉及到的N-乙酰葡萄糖胺异构酶（PmAGE）是AGE的一种，其包含384 个氨基酸，其在Genbank中的收录号为YP_001484631.1， （http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/YP_001484631.1），其氨基酸序列如SEQ ID NO： 2所示。编码该蛋白的基因含有1155bp碱基，其在Genbank中的收录号为NC_009840.1， (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_009840.1?report=genbank&from=1224454&to=1 225608)，其基因序列如SEQ ID NO：1所示。至今未发现PmAGE用于ManNAc合成 的报道。

【参考文献】：

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发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供N-乙酰葡萄糖胺异构酶在催化GlcNAc制备 ManNAc中的应用。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的N-乙酰葡萄糖胺异构酶在催化N-乙酰葡 萄糖胺合成N-乙酰甘露糖胺中的应用。

具体的方法是，以氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的N-乙酰葡萄糖胺异构酶为催 化剂，以N-乙酰葡萄糖胺为底物，不需要ATP作为辅因子，制备N-乙酰甘露糖胺。

更具体的方法是，表达基因序列如SEQ ID NO：1所示的重组菌，经过破碎与镍柱 纯化后，将纯酶与N-乙酰葡萄糖胺在缓冲液中反应得到N-乙酰甘露糖胺。

其中，基因序列如SEQ ID NO：1所示的重组菌的构建方法如下：以Prochlorococcus  marinus str.MIT9215基因组为模板扩增出N-乙酰葡萄糖胺异构酶的基因并连接到 pET-28a载体上，再将重组质粒转化入E.coli Rosetta(DE3)中。

其中，重组菌的表达方法如下：培养重组菌至OD₆₀₀=0.8时添加0.5mM IPTG，在 15℃、220rpm条件下诱导12h。

其中，镍柱纯化条件为：60mM咪唑溶液洗脱杂蛋白，500mM咪唑溶液洗脱纯酶。

其中，纯酶与N-乙酰葡萄糖胺的反应比为0.2-20U的纯酶与50-200mM N-乙酰葡 萄糖胺反应。

其中，所述的缓冲液为pH7～8.5的磷酸缓冲液或pH7～8.5的Tris-HCl缓冲液，优选 pH7.5的磷酸缓冲液或pH7.5的Tris-HCl缓冲液。

其中，纯酶与N-乙酰葡萄糖胺在缓冲液中反应条件为：温度35～38℃，反应时间 0.2～2h；优选，温度37℃，反应时间0.5h。

发明人基于现代生物信息学思想，结合分子生物学技术，采用基因工程的手段从海 藻Prochlorococcus marinus str.MIT9215克隆N-乙酰葡萄糖胺异构酶的基因，在大肠杆 菌中表达后发现其能催化GlcNAc生产ManNAc。

有益效果：本发明首次将氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的N-乙酰葡萄糖胺异构 酶应用于催化GlcNAc合成ManNAc中，取得很好的效果，其酶活高达2.37U/mg，而 且该反应中不需要添加辅因子ATP，大大降低了生产成本。

附图说明

图1为N-乙酰葡萄糖胺异构酶基因的构建图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会 限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：重组大肠杆菌E.coli Rosseta（pET28a-PmAGE）的构建。

1、N-乙酰葡萄糖胺异构酶基因的获取：

海洋来源的蓝藻Prochlorococcus marinus str.MIT9215（来自于Massachusetts  Institute of Technology的chisholm教授）细胞在液氮中冷冻1分钟后再转移到100℃沸 水中温浴10分钟。将如此处理过的海藻作为PCR的模板。

构建表达载体所用的引物加设酶切位点，引物序列如下：

上游引物（PmAGE-sense含EcoR I）为：

5′CCGGAATTCATGCAAAAATATATAAACGAATATCTAAG

下游引物（PmAGE-anti含Not I）为：

ATTTGCGGCCGCTTATTTAAACAATGTTGTATTTTTT

所有引物均由南京金斯瑞公司合成。

基因的PCR条件：

94℃变性5min，按如下参数循环30次：94℃变性1min，60℃退火50s，72℃ 延伸1.5min。最后72℃延伸10min。

2、重组大肠杆菌E.coli Rosseta转化：

用EcoR I及Not I分别酶切pET-28a（pET-28a购于Novagen(默克中国)）及所扩 增含有两个酶切位点的目的基因，分别胶回收已双酶切的目的片段和表达载体，将已双 酶切的表达载体pET-28a与目的基因用T4连接酶进行连接过夜，将10uL的连接产物 pET-28a-PmAGE加入100uL的Rosetta(DE3)感受态细胞中，冰上放置30min，42℃热激 90sec。冰上放置2min。加入预热的0.45mL培养基。220rpm37℃1h。将200uL菌液加 入分别含有100μg/mL的卡那霉素和氯霉素的LB平板上，37℃过夜培养12～16h。构建 图谱见图1。

实施例2：异构酶PmAGE的获取极其性质研究。

1、N-乙酰葡萄糖胺异构酶PmAGE的表达。

挑取重组菌E.coli Rosseta（pET-28a-PmAGE）至含抗生素的LB液体培养基中，37℃ 振荡培养过夜。然后按2%接种量分别接种到新鲜培养液中，37℃培养至OD₆₀₀约为0.6 时，加入IPTG至终浓度0.5mmol·L^-1，15℃，220rpm，诱导表达12h后，离心(4℃， 10000rpm，10min)。

2、N-乙酰葡萄糖胺异构酶PmAGE的纯化。

将收集的菌泥用含300mM NaCl和30%甘油的磷酸缓冲(50mM，pH7.5)重悬，超 声破碎细胞(功率300W，超声5s，间歇5s，共5min)，离心(4℃，12000rpm，15min)取 上清。

将收集到的上清酶液添加到Ni-NTA柱中，冰上保温30分钟。弃去穿透液后，用 含60mM咪唑，300mM NaCl和30%甘油的磷酸缓冲(50mM，pH7.5)洗去杂蛋白。 再用含500mM咪唑，300mM NaCl和30%甘油的磷酸缓冲(50mM，pH7.5)将目标蛋 白PmAGE洗脱下来。用12%的SDS-PAGE检测酶的纯度，得到电泳纯的PmAGE。 将纯化后的PmAGE用Tris-HCl缓冲（pH7.5）透析（M.W.3000的透析膜，透析24小 时）。蛋白浓度采用Brandford法进行测定。

3、N-乙酰葡萄糖胺异构酶PmAGE的底物特异性的研究。

酶活的检测方法：采用Agilent1200高效液相色谱，串联两根Bio-Rad Aminex87-H 柱进行检测（以10mM H₂SO₄为流动相，流速0.4ml/min，折光示差检测器）。酶活的定 义：每分钟内生产1μmol产物所需的酶量为一个酶活单位U。

在6管分别含有100mM的果糖、100mM甘露糖、100mM GlcNAc、100mM ManNAc、2mM6-磷酸果糖和2mM6-磷酸甘露糖Tris-HCl缓冲（pH7.5）中加入30ug/ml 的纯酶PmAGE。37℃水浴反应30分钟。

结果显示，重组菌E.coli Rosseta（pET28a-PmAGE）对底物GlcNAc的比酶活为2.4 U/mg，对底物ManNAc的比酶活为12.5U/mg。对其他底物均没有表现出催化活性。

4、ATP对N-乙酰葡萄糖胺异构酶PmAGE影响的研究。

在含100mM GlcNAc的Tris-HCl缓冲（pH7.5）中添加ATP(0-50mM)，再加入 30ug/ml的纯酶PmAGE。37℃水浴反应30分钟。

其逆反应为在含100mM ManNAc的Tris-HCl缓冲（pH7.5）中添加ATP(0-50mM), 再加入30ug/ml的纯酶PmAGE。37℃水浴反应30分钟。

表1

结果显示，PmAGE的酶活对ATP没有依赖性，低浓度ATP（5цm-5mM）对PmAGE 的酶活没有显著影响，而高浓度的ATP(20-100mM)对PmAGE具有显著的抑制作用，具 体数据见表1。