黑灵芝元素形态、活性成分及其保健功能研究

摘要

灵芝为担子菌纲、多孔菌科(Polyporaceae)灵芝属(Ganoderma)真菌灵芝(G.lucidum)和紫芝(G.japonicum)的总称，作为药物已有悠久历史。随着人们对灵芝化学成分及其药理作用的深入研究，证实灵芝具有多种有效成分和广泛的生物学作用，对人类神经系统、呼吸系统、内分泌及代谢系统、心血管系统均有一定功效，还能提高机体免疫力、保肝解毒、降血糖、抗肿瘤、抗衰老，在医药临床、保健食品、化妆品等领域得到广泛应用。但国内外研究过的灵芝属真菌仅有赤芝(G.lucidum)、紫芝(G.japonicum)、树舌(G.applanatum)、薄盖灵芝(G.capense)、南方灵芝(G.austrole)等5种，其中研究最多的是赤芝。迄今为止，尚未见有对黑灵芝进行系统研究的公开报道。 黑灵芝被称为灵芝中的极品，对人体保健具有的药用疗效，远比其它种类的灵芝为高。黑灵芝主要对肾脏机能有益，增强免疫功能，安眠醒脑，长期食用可调节体内多种机能，从而提高机体的整体素质和健康水平。为深入研究和开发黑灵芝资源，本文采用现代分离分析方法和生物技术手段，对江西赣州产黑灵芝进行了较为系统的研究，建立了一整套灵芝活性成分与功能实验的系统研究方法，所得结果可为黑灵芝高附加值产品的研究奠定相关理论和应用基础。现将主要研究结果归纳如下。 1.采用现代元素分析方法研究了黑灵芝中微量元素的含量及其溶出特性，比较了黑灵芝子实体及孢子粉、赤灵芝子实体及野生黑灵芝子实体中的元素含量，利用微波消解、ICP-MS同时测定了黑灵芝子实体和初步纯化多糖中微量元素及稀土元素的含量及形态分布。结果表明，黑灵芝子实体及孢子粉中Cu、Mn、Fe、Zn等元素的含量均高于赤灵芝子实体；黑灵芝酸性多糖中的微量元素及稀土元素的含量大多高于中性多糖；在江西黑灵芝及其多糖中含有痕量稀土元素Ce、Nd、Pr、Y。对黑灵芝样品元素测定的回收率在88.2％～110.6％。研究还发现，黑灵芝中微量元素在不同极性溶剂中具有不同的浸出率，绝大多数元素的溶出率随着溶剂极性增大而增大。初级形态分析参数计算结果表明，Cr、Co、Cd元素的浸出率最低，Zn、Fe、Cu和Mn的浸出率较高，Pb的浸出率最高，说明Pb比较容易溶出。大多数元素的头煎提取率T1＞二煎提取率T2，但T2值仍然较大，说明进行第二次提取非常有必要。滤渣中仍然含有部分元素残留。 2.采用传统与现代提取技术对黑灵芝中总三萜类成分的提取工艺进行了研究。通过溶剂提取法、超声提取法、微波萃取法和超临界萃取法提取工艺条件优化实验并进行比较，发现各类方法对黑灵芝总三萜类化合物的提取率由高至低依次为：微波萃取法＞超声提取法＞溶剂回流法＞超临界萃取法。微波提取法是溶剂提取法的8.9倍，且提取时间最短，溶剂用量也小；其最佳工艺条件为：95％乙醇，固液比为1∶25，萃取温度78℃，微波处理时间为5min，萃取2次。黑灵芝总三萜类化合物的萃取率达4.87％。 3.建立了黑灵芝总三萜类含量测定的分光光度法以及麦角甾醇的HPLC和TLC分析方法。总三萜类化合物显色条件为：5％香草醛-冰醋酸液0.2mL、高氯酸1.2mL，在70℃恒温水浴中加热15min，冷至室温，加入乙酸乙酯使总量为5mL，15min后在550nm处测定吸光度;以齐墩果酸作为标准对照品，回归方程为：A=0.0093C-0.0033(μg)，R2=0.9986(n=6)，线性范围0～128.4μg，RSD为4.09％，样品加标平均回收率为103.9％。用于黑灵芝中三萜类成分的溶剂回流提取、超声提取的测定，结果证明该方法准确可靠，可用于灵芝质量控制参考。麦角甾醇TLC条件为：展开剂为苯∶乙醇=96∶4，显色剂为1％香草醛-硫酸，比移值为0.48；HPLC条件为：AglientTC-C18(4.6×150mm，5μm)，G1315BDAD检测器，检测波长为282nm，流动相为甲醇，流速为1mL/min，室温。 4.采用硅胶柱层析、凝胶柱层析、薄层层析等色谱分离分析方法，结合NMR、MS等现代仪器手段对黑灵芝子实体中酸性组分进行了分离、纯化及结构表征，首次从黑灵芝中得到麦角甾醇、灵赤酸B甲酯、赤芝酸A等化合物。其分离纯化条件为：TLC展开剂为苯∶乙酸乙酯∶乙酸=7∶3∶0.2；硅胶柱层析以氯仿-甲醇梯度洗脱；凝胶柱为SephedexLH20；HPLC采用AlltimaC18，流动相为乙腈∶水=40∶60，流速1mL/min。 5.对黑灵芝提取物的抑菌和抗氧化活性进行了研究并与赤灵芝提取物进行了比较。结果表明，黑灵芝和赤灵芝的各种溶剂提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌均有一定的抑制作用，且黑灵芝和赤灵芝的抑菌效果比较一致。它们的乙酸乙酯提取物表现出较强的抑菌效果，大肠杆菌最低抑菌浓度(MIC)(％)为12.5％～25％，金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的MIC(％)均为25％。研究还发现，黑灵芝具有清除DPPH自由基、抑制O2-·自由基的作用，不同溶剂提取物的抗氧化活性强弱为：95％乙醇＞丙酮＞水＞氯仿，提取物用量与抗氧化活性成正相关，且黑灵芝提取物比赤灵芝提取物的抗氧化能力强：黑灵芝95％乙醇提取物的自由基半清除率浓度EC50=0.2(mg/mL)，而赤灵芝95％乙醇提取物的EC50=0.25(mg/mL)；黑灵芝的丙酮提取物浓度达到1mg/mL时已超过10mg/mLBHT清除DPPH·自由基的能力，相当于0.5mg/mL抗坏血酸的抗氧化效果；赤灵芝的丙酮提取物浓度达到3mg/mL时稍高于5mg/mLBHT清除DPPH·自由基的能力，略低于0.5mg/mL抗坏血酸的抗氧化效果。从O2-·自由基抑制率来看，黑灵芝丙酮提取物浓度在低于1mg/mL时，抑制O2-·自由基的能力高于同浓度的赤灵芝丙酮提取液，且其浓度在0.5mg/mL时的抑制率是5mg/mLBHT抗氧化能力的两倍。上述结果表明黑灵芝具有较强的抗氧化作用，且优于赤灵芝。

目录

文摘

英文文摘

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第一章 绪论

第二章 黑灵芝中元素的形态分析

第三章 黑灵芝三萜化合物的定量测定-分光光度法的建立

第四章 黑灵芝三萜类化合物提取工艺的研究

第五章 黑灵芝中麦角甾醇的分离提取、分析方法研究

第六章 黑灵芝子实体中活性成分的分离纯化及结构鉴定

第七章 黑灵芝提取物的抑菌和抗氧化活性研究

第八章 结论

致谢

参考文献

附录

攻读博士学位以来论文及科研情况