慢病毒介导shRNA沉默Fg12基因对心肌微血管内皮细胞增殖、迁移的影响及其机制的研究

摘要

目的:原代分离培养大鼠心肌微血管内皮细胞(Myocardial MicrovascularEndothelial Cells MMVECs),通过免疫荧光鉴定。构建人纤维介素(fgl2)的RNA干扰慢病毒表达载体,转染MMVECs。转染96小时后,qRT-PCR检测fgl2、Ang1、Ang2、Tie2、AKT2的表达。探讨fgl2对MMVECs增殖、迁移的影响及其机制。
　　 方法:(1)心肌微血管内皮细胞的分离培养与鉴定:取5-7天龄健康、清洁级Sprague-Dawley(SD)大鼠,取出心脏,洗净血液,剪去心房及右心室,保留左心室,剥离心内膜及心外膜。酒精灭活30秒。剪碎心肌组织,用胰蛋白酶及胶原酶Ⅱ消化,消化分离细胞,经差速贴壁,获得较纯的MMVECs。待原代内皮细胞长成单层融合后,进行传代。取第二代MMECs,免疫荧光检测内皮细胞重要标志物FVⅢ相关抗原及CD31相关抗原。
　　 (2)在GeneBank中查到人纤维介素fgl2(NM_006682)的碱基序列,设计4个SiRNA序列,并制备含正义链和反义链的双链DNA oligo,退火合成双链DNA(引物),与经AgeI/EcoRI酶切pGCSIL—GFP载体连接,产生pGCSIL—Fgl2慢病毒载体,经AgeI/EcoRI酶切电泳筛选阳性克隆,测序鉴定。pGC-LV、pHelper1.0、pHelper慢病毒载体共转染293T细胞,包装生产慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平来测定病毒滴度。
　　 (3)实验分组:取大鼠第三代MMVECs,实验A组:单纯MMVECs(对照组)；实验B组；空载质粒慢病毒(GFP组)；实验C组:fgl2短发夹RNA(short hairpin RNA；shRNA)慢病毒(fgl2-RNAi-LV组)。稳定转染4天后,实时定量qRT—PCR(quantitative real-time RT—PCR,qRT-PCR)检测各组fgl2、Ang1、Ang2、Tie2、AKT2的mRNA表达。MTT检测细胞增殖。Transwell检测细胞迁移能力。
　　 结果:(1)原代心肌微血管内皮细胞培养成功,纯度达95％左右,呈铺路石样结构。
　　 (2)免疫荧光法检测,显示90％以上细胞的FVⅢ、CD31阳性,FVⅢ主要分布在细胞胞浆,呈绿色荧光,CD31主要分布在细胞膜,呈红色荧光。
　　 (3)酶切及DNA测序表明,fgl2shRNA慢病毒表达载体构建成功。包装慢病毒,测得浓缩病毒滴度为1*109TU/ml,转染fgl2shRNA慢病毒96 h后,70-80％的MMVECs表达GFP,qRT-PCR结果显示,与实验A组与B组比较,实验C组的fgl2表达明显下调,Ang1、Ang2、Tie2、AKT2明显上调,MMVECs的增殖能力与迁移能力增强。具有统计学差异(P<0.05),而实验A组与实验B组无明显差异。
　　 结论:fgl2shRNA慢病毒载体构建成功,转染fgl2shRNA慢病毒载体后MMVECs的fgl2表达水平明显下调,Ang1、Ang2、Tie2、AKT2明显上调；fgl2shRNA慢病毒转染MMVECs,MMVECs的增殖能力与迁移能力增强,可能通过上调Ang1和Ang2的表达来促进血管生成,fgl2基因通过RNA干扰为治疗血管新生障碍性疾病提供了新的靶点。