免疫磁珠分离结合荧光微球免疫层析方法的建立及在大肠杆菌O157:H7检测中的应用

摘要

大肠杆菌O157∶H7是肠出血性大肠杆菌（EHEC）中最具代表性的血清型，能引起腹泻、出血性结肠炎、溶血性尿毒综合症或血栓形成性血小板减少性紫癜等疾病，该菌已在世界范围内引起感染流行。因此，探索建立能适用于现场或基层的灵敏度高、特异性强的检测方法，对于该菌的防控具有重要意义。免疫层析方法以其检测快速、操作简便、灵敏度高等特点成为该菌筛查中的常用方法。
　　 标记物的选取在免疫层析技术中至关重要，目前，胶体金的应用最为广泛。本研究在大量的前期工作基础上，比较了纳米荧光微球和胶体金作为标记物偶联抗大肠杆菌O157∶H7单克隆抗体的偶联率，制备了基于双抗体夹心原理的荧光微球微球试纸条(FM-ICTS)和胶体金试纸条(CG-ICTS)，首次对抗体与标记物的偶联规律对免疫层析方法的影响进行了深入细致的比对研究。单抗与荧光微球的偶联率随着抗体投入量的增加而降低，但是偶联到微球表面的抗体量却不断增加，当抗体与荧光微球的比例达到100μg/mg时，层析方法的灵敏度不会再随抗体标记量增加而提高;单抗与胶体金的偶联率并未随抗体投入量的增加呈现规律性变化，当抗体与胶体金的比例达到10μg/mL时，增加抗体的投入量也不会提高试纸条灵敏度。最终结果显示，FM-ICTS的灵敏度为9.6×103 CFU/mL，要比CG-ICTS的灵敏度高约5倍，每张FM-ICTS消耗的单抗量为0.1μg，而每张CG-ICTS消耗的单抗量为0.4μg，所以在该检测体系中，从检测灵敏度和抗体使用量角度比较，荧光微球更具优势。当菌液浓度高于106 CFU/mL后，检测线(T线)出现信号降低的趋势，出现免疫层析中较少报道的HOOK效应，印证了层析反应也遵从ELISA免疫反应规律，此效应在FM-ICTS和CG-ICTS现象一致。
　　 免疫磁性分离技术(IMS)已广泛应用于致病菌的分离中，本研究IMS与FM-ICTS相结合，成功的应用于生牛乳中大肠杆菌O157∶H7的检测。1mL纯培养大肠杆菌O157∶H7肉汤体系，用IMS富集浓缩10倍后用于FM-ICTS检测，能明显缩短60 min预增菌时间。接种量为0.5、2 CFU/g的生牛乳，选择性增菌后用FM-ICTS检测，分别至少需要培养11、9h才能检出阳性信号，而用免疫磁分离结合FM-ICTS的方法只需9、7h即可检测阳性信号，IMS能消除生牛乳增菌肉汤基质的影响，提高检测灵敏性。

目录

声明

摘要

缩略语表

第1章 引言

1．1 大肠杆菌O157∶H7概述

1．2 大肠杆菌O157∶H7检测技术分类

1．3 免疫层析技术中的标记物

1．4 免疫磁分离技术

1．5 本文研究内容和意义

第2章 荧光微球和胶体金在免疫层析方法中的比较

2．1 材料与仪器

2．1．1 主要试剂及材料

2．1．2 主要仪器设备

2．1．3 主要试剂的配制

2．2 实验方法

2．2．1 荧光微球偶联抗体

2．2．2 胶体金偶联抗体

2．2．3 制备免疫层析试纸条

2．2．4 免疫层析试纸条的评价

2．2．5 HOOK效应

2．3 结果与分析

2．3．1 标记物表征

2．3．2 不同投入量抗体对偶联效率和FM-ICTS灵敏度的影响

2．3．3 不同投入量抗体对偶联效率和CG-ICTS灵敏度的影响

2．3．4 试纸条平衡时间的确定

2．3．5 FM-ICTS和CG-ICTS的比较

2．3．6 HOOK效应

2．4 讨论

第3章 免疫磁性分离技术结合荧光微球试纸条检测生牛乳中大肠杆菌O157∶H7

3．1 材料与仪器

3．1．1 主要试剂及材料

3．1．3 主要仪器设备

3．1．4 主要试剂的配制

3．2 实验方法

3．2．1 菌株培养

3．2．2 FM-ICTS的灵敏度和特异性

3．2．3 IMS对FM-ICTS检测增菌时间的影响

3．2．4 FM-ICTS结合IMS对生牛乳食品基质检测

3．3 结果与分析

3．3．1 FM-ICTS的灵敏度和特异性

3．3．2 FM-ICA+IMS对增菌时间的影响

3．3．3 生牛乳中大肠杆菌O157∶H7的检测

3．4 讨论

第4章 结论与展望

4．1 结论

4．1．1 单抗与荧光微球、胶体金的量优比倒

4．1．2 FM-ICTS和CG-ICTS的灵敏度和单抗消耗量

4．1．3 FM-ICTS和CG-ICTS上的HOOK效应

4．1．4 IMS结合FM-ICTS检测生牛乳中大肠杆菌O157∶H7

4．2 展望

致谢

参考文献

附录1 试剂药品

附录2 仪器设备

附录3 菌株目录

攻读学位期间的研究成果