结肠癌细胞中miR-21对5-Fu代谢相关酶的调控及其靶基因的验证

摘要

目的:
　　临床上肿瘤病人耐药是一个相当棘手的问题，了解耐药机制迫在眉睫。miR-21可能在结肠癌耐药机制中发挥重要作用，本研究即以探索结肠癌5-Fu耐药机制的新线索为目的，可能为临床个体化治疗提供新的预测指标。
　　方法:
　　本研究选用人结肠癌HT-29细胞系进行实验，经携带不同基因片段的慢病毒转染细胞以调节miR-21的表达及作用，采用荧光素酶报告系统验证hMSH2为miR-21的潜在靶点。此外还采用TaqMan探针法qRT-PCR及Western Blotting两种技术方法分别从RNA水平及蛋白分子水平来检测随着miR-21的调节5-Fu代谢相关酶及hMSH2表达量的变化。
　　结果:
　　1、荧光素酶报告基因检测hMSH2为miR-21的潜在靶基因。miR-21下调组荧光素酶活性明显增强(p＜0.001)，而miR-21上调组的荧光素酶活性明显减弱(p＜0.001)，结果表明miR-21能够直接靶向结合于hMSH2的3'UTR端。
　　2、TaqMan探针法实时荧光定量PCR从RNA水平进一步验证了miR-21对hMSH2的靶向作用，此外还表明miR-21与TP酶、DPD酶的表达存在负性调节作用(p＜0.05)。
　　3、在蛋白水平上通过Western Blotting发现miR-21对hMSH2以及TP酶、DPD酶表达的影响趋势与RNA水平相一致，但对TS酶的表达无明显影响。
　　结论:
　　hMSH2是miR-21的潜在靶基因，同时miR-21可能参与了TP酶及DPD酶表达的部分调节过程，这在结肠癌对5-Fu的耐药过程中可能发挥了重要的作用。因此miR-21也许能够成为结肠癌患者是否接受5-Fu方案化疗的预测因子。

目录

声明

摘要

中英文缩略词

第1章 引言

第2章 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 细胞与培养方法

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要仪器设备

2．2 实验方法

2．2．1 HT-29结肠癌细胞系的培养

2．2．2 慢病毒转染入人结肠癌HT-29细胞

2．2．3 靶基因的预测

2．2．4 双荧光素酶报告系统检测hMSH2为miR-21靶基因

2．2．5 提取总RNA，逆转录成cDNA，进行qRT-PCR

2．2．6 Western Blotting

2．3 统计学处理

第3章 结果

3．1 慢病毒转染人结肠腺癌HT-29细胞效率

3．2 双荧光素酶报告系统建立，并确定hMSH2为miR-21的靶基因

3．2．1 hMSH2-3’UTR双荧光素奠报告系统建立

3．2．2 hMSH2为miR-21的靶基因

3．3 qRT-PCR检测5组HT-29细胞中TS酶、TP酶、DPD酶、hMSH2的基因表达情况

3．4 Western Blotting从蛋白水平检测miR-21上调或下调对TS酶、TP酶、DPD酶、hMSH2表达情况的影响

第4章 讨论

第5章 结论

致谢

参考文献

综述 miR-21与结肠癌耐药机制的研究进展