人软骨肉瘤中miR-140-5p靶基因预测验证及对靶基因表达的调控作用观察

摘要

目的 预测并验证人软骨肉瘤中miR-140-5p的靶基因,观察人软骨肉瘤中miR-140-5p对靶基因的调控作用.方法 ①miR-140-5p在人软骨肉瘤中的靶基因预测及验证:采用microRNA.org软件检索miR-140-5p序列,miRBase、miRWalk靶基因预测分析数据库预测miR-140-5p在人软骨肉瘤中的靶基因,认为miR-140-5p在人软骨肉瘤中的靶基因可能为葡萄糖转运蛋白1(GLUT-1).通过NCBI GenBank检索GLUT-13′UTR序列.构建野生型(WT,正常表达)、突变型(MUT,抑制表达)GLUT-13′UTR双荧光素酶报告载体.取人胚肾细胞HEK 293T分为A、B组,分别转染miR-140-5p mimics(促进miR-140-5p表达)+WT型GLUT-13′UTR荧光素报告载体、miR-140-5p mimics+MUT型GLUT-13′UTR荧光素报告载体,利用荧光素酶活性检测试剂盒测算萤火虫荧光素酶相对活性.②转染miR-140-5p对人软骨肉瘤细胞株JJ012的GLUT-1 mRNA及蛋白表达影响:取对数生长期JJ012细胞分为观察组、对照组,分别转染miR-140-5p mimics、NC mimics(空白无意义),转染24 h时采用qRT-PCR法检测两组细胞GLUT-1 mRNA,采用Western blotting法检测两组细胞GLUT-1蛋白.结果 ①miR-140-5p在人软骨肉瘤中的直接靶基因可能为GLUT-1.A、B组荧光素酶活性分别为0.37±0.03、0.93±0.01,二者比较,P<0.05.②观察组、对照组细胞GLUT-1 mRNA相对表达量分别为0.31±0.10、0.95±0.06,二者比较,P<0.05.观察组、对照组细胞GLUT-1蛋白相对表达量分别为0.42±0.13、0.93±0.07,二者比较,P<0.05.结论 miR-140-5p在人软骨肉瘤中的靶基因可能为GLUT-1.miR-140-5p主要通过靶向结合GLUT-13′UTR区域进行mRNA转录后调控.miR-140-5p主要通过直接靶向作用于GLUT-13′UTR进而抑制蛋白翻译过程.