米曲霉Aspergillus oryzae A-F04中甘氨酸氧化酶基因的克隆及其工程菌株构建

摘要

本文以实验室前期筛选的米曲霉为出发菌株,通过液相测定不同米曲霉的草甘膦降解率;通过相关文献和NCBI比对初步选定甘氨酸氧化酶为米曲霉中草甘膦降解酶;提取不同米曲霉菌株的DNA,通过PCR得到甘氨酸氧化酶的基因序列,并通过软件进行序列分析;选择降解能力最强的米曲霉为出发菌株,提取DNA,进行基因组DNA的PCR,得到甘氨酸氧化酶基因序列,通过基因工程技术,将其导入毕赤酵母表达系统中,得到含甘氨酸氧化酶基因的毕赤酵母工程菌株。
　　现将本文主要研究结论概况如下:
　　1.采用液相色谱法测定不同米曲霉菌株的草甘膦降解率,降解率最强的为米曲霉(Aspergillus oryzae)A-F04,达到12.5％。
　　2.提取不同米曲霉菌株的 DNA,PCR扩增后得到不同的甘氨酸氧化酶序列,测序结果发现只有米曲霉A-F04发生基因突变。米曲霉(Aspergillus oryzae) A-F04的ORF DNA序列全长1263bp,编码一个由420aa组成的蛋白质,其理论分子量为102933.4 Da,理论等电点为5.03,是一个弱酸性蛋白。米曲霉(Aspergillus oryzae)A-F04编码的甘氨酸氧化酶有96%的同源性,两者相差16个氨基酸。对该氨基酸序列进行结构域架构分析结果表明该序列具有明显的 D-氨基酸氧化酶结构域,并且发现了与FAD上腺膘呤结合的六肽基序。
　　3.在培养基中添加草甘膦和正常组相比发现:在含草甘膦的发酵培养基中生长的米曲霉菌丝体个数少并且个体较大,正常组菌丝体数目多而小,表明草甘膦对米曲霉有一定的毒性作用,抑制米曲霉孢子萌发。
　　4.提取DNA,进行基因组DNA的PCR,得到甘氨酸氧化酶基因序列,通过限制性内切酶EcoR I和Not I,将切胶回收纯化的PCR产物和毕赤酵母表达载体pPlC9K分别进行双酶切,并将酶切产物进行酶连,将酶连产物导入大肠杆菌DH5α感受态细胞,通过氨苄青霉抗性筛选和 PCR鉴定,最终得到重组质粒pPIC9K-AFGO。
　　5.将重组质粒pPIC9K-AFGO线性化之后点击导入到毕赤酵母GS115的基因组中,通过筛选得到含甘氨酸氧化酶基因的毕赤酵母工程菌株GS115-AFGO。

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第1章 前言

1.1 草甘膦概述

1.2 国内外降解草甘膦的微生物及草甘膦降解基因的研究进展

1.3 毕赤酵母表达系统简介

1.4 本课题立项背景及意义

1.5 课题的主要研究内容

第2章 多株米曲霉草甘膦降解率测定及甘氨酸氧化酶的生物信息学分析

2.1 引言

2.2 试验试剂与仪器设备

2.3 试验方法

2.4 结果与讨论

2.5 本章小结

第3章 米曲霉A-F04甘氨酸氧化酶的毕赤酵母表达载体构建

3.1 引言

3.2 试验试剂与仪器设备

3.3 试验方法

3.4 结果与讨论

3.5 本章小结

第4章 米曲霉A-F04甘氨酸氧化酶的毕赤酵母工程菌株构建

4.1 引言

4.2 试验材料

4.3 试验方法

4.4 结果与讨论

第5章 结论与展望

5.1 本文结论

5.2 下步工作方向

致谢

参考文献