牛乳主要过敏原α-乳白蛋白B细胞表位的定位

摘要

牛乳及乳制品因其含有较高的营养价值而受到广大消费者的青睐，但同时牛乳及牛乳制品是导致食物过敏的八大类食物之一，其中α-乳白蛋白是牛乳中的最主要过敏原之一。食物过敏反应是一种免疫学变态反应，其反应的物质基础是抗原表位与抗体对位。开展表位定位及特性研究可深入了解α-乳白蛋白致敏的物质基础，有助于更好地认识α-乳白蛋白在乳过敏反应中的作用，为基于表位靶标而制备低过敏乳制品提供理论指导。
　　本课题以牛乳α-乳白蛋白为研究对象，由亲和纯化牛乳过敏患者的特异性IgE和IgG抗体为靶分子，亲和淘选噬菌体随机肽库，最终通过网络服务器定位出牛乳α-乳白蛋白表位，研究的主要方法、结果及结论如下。
　　1.通过ImmunoCAP，从19位儿童牛乳过敏患者血清中筛选出8个抗牛乳α-乳白蛋白的S-IgE值大于0.35 kUA/l的患者血清，并等体积混合得血清池。利用Sepharose4B免疫层析柱和Protein G免疫层析柱两步法纯化抗牛乳α-乳白蛋白特异性IgG和IgE抗体，经SDS-PAGE电泳检测结果表明制备的抗牛乳α-乳白蛋白人血清IgG和IgE纯度分别为93.8％和85.3%。
　　2.以特异性IgE和 IgG抗体为靶分子，分别对噬菌体随机环七肽库和十二肽库进行亲和淘选，并从第三轮中随机挑选48个克隆子，采用ELISA进行阳性鉴定，通过DNA测序得到模拟肽氨基酸序列，由此获得抗牛乳α-乳白蛋白B细胞结合的线性和构象性模拟表位肽。
　　3.借助UniProt软件，将线性表位模拟肽与牛乳α-乳白蛋白序列进行比对，依据氨基酸的基本性质，定位出七个IgE和六个IgG线性结合表位。其中IgE线性表位序列为AA41-46，AA55-60，AA62-72，AA74-76，AA85-90和AA92-99， IgG线性表位序列为AA37-46，AA52-54，AA56-59，AA63-72，AA74-76，AA81-90和 AA92-99。通过对比发现，组成牛乳α-乳白蛋白线性表位的主要氨基酸为天冬氨酸和赖氨酸，其次为天冬酰胺，异亮氨酸和谷氨酰胺。
　　4.通过网络服务器，将环七肽库得到的模拟肽与牛乳α-乳白蛋白进行空间模拟、计算及优化，定位出六个IgE和三个IgG结合的构象性表位。其中IgE构象性表位的序列分别为 K62-N71-I75-S76-K79， K62-I75-S76-K79-L81， P24-E25-K114-L115-Q117-L119， L105-H107-K108-L110， V42-Q43-S47-T48-Q65-P67和N44-S47-T48-E49-Y50-K79-L81。IgG结合的构象性表位的序列分别F9-R10-K13-K16-L23-P24-L119，I59-Q65-P67-S69-N71-I75A和Q39-I41-N44-S47-T48。通过序列比对发现，牛乳α-乳白蛋白构象性表位的主要氨基酸为赖氨酸，亮氨酸，异亮氨酸和谷氨酰胺。

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第1章 引言

1.1 牛乳过敏及其免疫学机制

1.2噬菌体展示技术

1.3 立题背景与研究内容

第2章 抗牛乳α-乳白蛋白特异性抗体的纯化

2.1引言

2.2材料与设备

2.3实验方法

2.4结果与分析

2.5 讨论

2.6 小结

第3章 牛乳α-乳白蛋白的B细胞结合表位的噬菌体模拟肽淘选

3.1引言

3.2材料与设备

3.3实验方法

3.4结果与分析

3.5 讨论

3.6 小结

第4章 牛乳α-乳白蛋白的B细胞结合表位

4.1引言

4.2实验材料

4.3实验方法

4.4结果与分析

4.5 讨论

4.6 小结

第5章 结论与展望

5.1 结论

5.2展望

致谢

参考文献

硕士期间研究成果