金磁酶联免疫法检测牛乳过敏原酪蛋白、α-乳白蛋白的研究

摘要

牛乳制品含有丰富的营养，同时乳及乳制品也是WHO认定的导致人类过敏的八大类食物之一。其中牛乳中的酪蛋白(casein，CN)及α-乳白蛋白(α-lactalbumin，α-LA)被视为主要的过敏原，因此开展针对食品中酪蛋白及α-乳白蛋白强特异性、高灵敏度的检测具有重要的理论和现实意义。具体研究内容如下:
　　1、酪蛋白、α-乳白蛋白单克隆抗体的制备。
　　以CN、α-LA各免疫4只BALB/c小鼠，用间接ELISA法测小鼠抗血清效价，获得效价最高的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，获得杂交瘤细胞。间接ELISA法筛选阳性孔，有限稀释法进行3次亚克隆得到分泌同质的杂交瘤细胞株。最终筛选到1株分泌酪蛋白单抗、2株分泌α-乳白蛋白单抗的杂交瘤细胞株分别为3D3、11G10、11F8。采用小鼠体内诱生腹水法大量制备单抗。
　　2、酪蛋白、α-乳白蛋白单抗的鉴定
　　采用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化单抗腹水，经SDS-PAGE电泳表征单抗纯度，采用间接竞争ELISA、Western-blotting、非竞争性ELISA法分别检测单抗效价、特异性及亲和力，结果显示CN、α-LA单抗浓度分别为8.425mg/mL和8.591mg/mL。抗CN3D3单抗，抗α-LA11G10、11F8单抗效价分别为1∶256000、1∶512000、1∶128000。并检测两类单抗亚类均为IgG1型。酪蛋白、α-乳白蛋白单抗亲和常数分别为0.32×108L/mol和0.37×108L/mol。
　　3、金磁(Fe3O4/Au)复合微粒与酶标抗原的制备。
　　采用一锅法制备氨基化的磁性微粒Fe3O4-PEI，之后在其表面包覆两层Au颗粒，制备金磁(Fe3O4/Au)复合微粒，金磁复合微粒形貌呈圆形，粒径均一，粒径约170-185nm。采用过碘酸钠法制备辣根过氧化物酶(HRP)标记CN/α-LA，计算CN-HRP和α-LA-HRP蛋白浓度分别为1.991mg/mL，2.816mg/mL; CN-HRP与α-LA-HRP的酶活损失率分别为8.7％、7.63％。
　　4、金磁酶联免疫法检测牛乳过敏原CN/α-LA体系的建立。
　　按照最佳条件制备得到金磁免疫探针和CN/α-LA酶标抗原后，将它们与CN/α-LA标准溶液竞争结合建立金磁酶联免疫检测体系，初步探究了该体系在牛乳中CN/α-LA检测的可行性。研究结果显示CN浓度在4ng/mL～256ng/mL范围内，CN浓度对数与抑制率有较好的线性关系，标准曲线为y=32.654x-5.17143，R2=0.993;IC50为50ng/mL，LOD为2.9ng/mL。α-乳白蛋白浓度在2ng/mL～256ng/mL检测范围内有较好的线性关系，标准曲线为y=35.718x-2.8429，R2=0.99545;IC50为30.2ng/mL，LOD为2.3ng/mL。此外，对该检测体系进行方法学评价，结果显示该方法精密度、特异性、稳定性均较好。CN、α-LA回收率分别在82％～105％和87.1％～111％范围内，满足对CN/α-LA检测的要求。在食品安全检测中有重要的实际应用价值。

目录

摘要

主要符号表

第1章 绪论

1．1 食品过敏与过敏危害

1．1．1 食品过敏现状

1．1．2 食品过敏原危害

1．1．3 过敏原相关法律法规

1．2 牛乳过敏与主要过敏原

1．2．1 牛乳过敏现象

1．2．2 牛乳主要过敏原

1．3 食品过敏原检测技术研究现状

1．3．1 体内检测技术分析

1．3．2 体外检测分析技术

1．3．3 仪器检测分析技术

1．4 金磁纳米材料及在生物检测中的研究现状

1．4．1 金磁纳米材料及其结构

1．4．2 金磁微粒在生物检测中的应用

1．5 酶标抗原在生物检测中的研究现状

1．5．1 酶标抗原简介

1．5．2 酶标抗原研究现状

1．6 本课题的研究目的和主要内容

1．6．1 研究目的

1．6．2 主要内容

第2章 酪蛋白、α-乳白蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

2．1 前言

2．2 实验材料、试剂及仪器

2．2．1 实验材料、试剂

2．2．2 仪器与设备

2．3 实验方法

2．3．1 主要溶液的配制

2．3．2 BALB／c小鼠的免疫

2．3．3 小鼠血清效价的测定

2．3．4 杂交瘤细胞株的建立

2．3．5 单克隆抗体的大量生产

2．3．6 腹水纯化及效价的测定

2．3．7 单克隆抗体浓度的测定

2．3．8 单克隆抗体特异性鉴定

2．3．9 单抗亚类鉴定

2．3．10 单抗亲和力的鉴定

2．4 结果与讨论

2．4．1 小鼠血清效价、杂交瘤细胞阳性孔筛选及单抗效价的测定

2．4．2 腹水纯化及SDS-PAGE鉴定

2．4．3 单克隆抗体浓度的测定

2．4．4 单克隆抗体特异性鉴定

2．4．5 单克隆抗体亚类鉴定分析

2．4．6 单克隆抗体亲和力的分析

2．5 本章小结

第3章 金磁(Fe3O／Au)复合微粒与酶标抗原的制备

3．1 前言

3．2 实验材料及仪器

3．2．1 实验材料及试剂

3．2．2 仪器与设备

3．3 实验方法

3．3．1 金磁复合纳米粒子的制备

3．3．2 酪蛋白、α-乳白蛋白酶标抗原的制备

3．3．3 酶标抗原蛋白浓度的测定

3．3．4 酶标抗原酶活力的检测

3．3．5 酶标抗原的酶活损失测定

3．4 结果与讨论

3．4．1 胶体金的表征

3．4．2 金磁复合纳米粒子的表征

3．4．3 酶标抗原蛋白浓度的测定

3．4．4 酶标抗原的活性鉴定

3．4．5 酶标抗原的酶活损失测定

3．5 本章小结

第4章 金磁酶联免疫法检测酪蛋白、α-乳白蛋白方法的建立

4．1 前言

4．2 实验材料、试剂及仪器

4．2．1 实验材料、试剂

4．2．2 实验仪器

4．3 实验方法

4．3．1 金磁探针的制备及优化

4．3．2 金磁酶联免疫法检测牛乳中酪蛋白、α-乳白蛋白方法的建立

4．3．3 金磁酶联免疫法检测体系条件的优化

4．3．4 检测体系评价

4．4 结果与讨论

4．4．1 金磁探针的制备及优化

4．4．2 金磁酶联免疫法检测酪蛋白、α-乳白蛋白方法条件的优化

4．4．3 金磁酶联免疫法检测酪蛋白标准曲线的制作

4．4．4 金磁酶联免疫法检测α-乳白蛋白标准曲线的制作

4．4．5 检测体系评价

4．5 本章小结

第5章 结论与展望

5．1 结论

5．2 进一步工作的方向

参考文献

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

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