NAC对H.pylori诱导Balb/c小鼠慢性胃炎的保护作用及对PI3K/Akt信号通路的影响

摘要

背景和目的：幽门螺杆菌（Hp）是一种最常见的能引起慢性感染的细菌，影响着至少一半的世界人口。感染者中约15~20％和1%将发展成消化性溃疡和胃癌。研究发现Hp感染可引起组织或细胞内活性氧（ROS）含量增加。过量的ROS可引起氧化应激,破坏细胞脂质、蛋白质、DNA、RNA等,引起一系列疾病甚至肿瘤的发生。N-乙酰半胱氨酸（NAC）是一种抗氧化剂，当组织发生氧化应激损伤时，可以通过清除氧自由基发挥抗氧化作用及保护细胞的目的。PI3K/Akt信号通路具有抗凋亡、促增殖作用。本课题的前期研究通过体外实验证实：Hp感染GES-1后可增加细胞内ROS含量，引起DNA损伤，且可激活Akt信号通路；NAC可通过清除ROS减轻DNA损伤，也可抑制Akt信号通路的激活。
　　由于体外实验与人整体系统存在差异，缺乏细胞与组织的修复过程和宿主免疫因素的影响等。所以，我们针对前期的研究结果，设计动物实验，进一步加以证实。以Hp感染Balb/c小鼠建立慢性胃炎动物模型，并使用抗氧化剂NAC清除生成的ROS。通过检测NAC干预后小鼠胃组织ROS、MDA、GSH含量的变化，DNA损伤情况以及Akt信号通路蛋白的表达，探讨NAC在Hp感染诱导的慢性胃炎过程中的保护作用及对Akt信号通路的影响。
　　方法：
　　一、H.pylori感染Balb/c小鼠慢性胃炎及NAC干预模型的建立
　　1、选用60只清洁级Balb/c小鼠随机分为5组，每组12只：A组为正常对照组，给予布氏肉汤+蒸馏水；B组为Hp模型组，给予Hp混悬液+蒸馏水；C组为NAC药物对照组，给予布氏肉汤+NAC；D组为Hp+NAC干预组，给予Hp混悬液，同时于造模的前12周给予NAC；E组为Hp+NAC治疗组，同时于造模的后12周给予NAC，直至实验结束。于Hp末次灌胃后的第24周处死小鼠，取胃组织标本进行实验相关指标的检测。
　　2、Hp定植的检测：Gimesa染色和PCR联合检测，二项中一项阳性，即为Hp阳性。
　　3、HE染色进行组织病理学分析。
　　4、ROS的检测：DCFH-DA探针法检测各组胃粘膜组织ROS含量。
　　5、根据Hp定植检测阳性，病理组织学可见胃粘膜慢性炎症反应以及NAC干预后ROS含量下降，提示成功建立Hp感染相关的慢性胃炎及NAC干预动物模型。
　　二、小鼠胃组织MDA、GSH含量变化以及DNA损伤情况
　　1、硫代巴比妥钠酸(TBA)法检测各组胃粘膜组织氧化损伤产物MDA含量；
　　2、Beutler改良法检测各组胃粘膜组织抗氧化物质GSH含量；
　　3、免疫组化检测各组胃粘膜组织中DNA损伤标记物8-OHdG的含量。
　　三、检测Akt信号通路蛋白的表达
　　免疫组化联合western-blot法：检测各组胃粘膜组织中Akt、p-Akt、GSK3-β、p-GSK3-β相关蛋白的表达。
　　结果：
　　一、Hp感染Balb/c小鼠慢性胃炎及NAC干预模型
　　1、Hp定植：正常对照组及药物对照组未检出H pylori，Hp模型组、Hp+NAC干预组、Hp+NAC治疗组小鼠均检出H pylori。
　　2、病理组织学结果：正常对照组和NAC药物对照组小鼠胃粘膜固有层和黏膜下层无或几个淋巴细胞散在分布；Hp模型组小鼠胃粘膜固有层和黏膜下层可见较多淋巴细胞、嗜酸性粒细胞浸润；Hp+NAC干预组和Hp+NAC治疗组小鼠胃粘膜固有层和黏膜下层也可见散在的几个或十余个淋巴细胞、嗜酸性粒细胞浸润。Hp模型组炎症程度高于正常对照组,有显著差异（p<0.05）；Hp+NAC干预组、Hp+NAC治疗组炎症程度与Hp模型组相比，差异无统计学意义(p>0.05)。
　　3、ROS含量：与正常对照组比较：Hp模型组胃组织ROS水平增加，差异有统计学意义（p<0.05）；NAC药物对照组胃组织ROS水平无显著差异（p>0.05）。与Hp模型组比较：Hp+NAC干预组、Hp+NAC治疗组ROS水平均降低，差异有统计学意义(p<0.05)。
　　4、根据以上结果提示造模成功。
　　二、NAC对小鼠胃粘膜组织Hp基因拷贝数、MDA、GSH含量及DNA损伤的影响
　　1、PCR定量检测Hp结果：与正常对照组比较：Hp模型组胃粘膜Hp基因拷贝数明显升高(p<0.01)；NAC药物对照组胃粘膜Hp基因拷贝数无显著差异（p>0.05）；与Hp模型组比较：Hp+NAC干预组、Hp+NAC治疗组胃粘膜Hp基因拷贝数均降低，差异有显著性(p<0.01)。
　　2、MDA含量:与正常对照组比较：Hp模型组胃组织MDA水平明显升高,差异有统计学意义(p<0.01)；NAC组胃组织MDA水平无显著差异（p>0.05）。与Hp模型组比较：Hp+NAC干预组、Hp+NAC治疗组MDA水平均降低，差异有统计学意义(p<0.01)。
　　3、GSH含量：与正常对照组比较：Hp模型组胃组织GSH水平明显降低，差异有统计学意义(p<0.01)；NAC组胃组织GSH水平无显著差异（p>0.05）。与Hp模型组比较：Hp+NAC干预组、Hp+NAC治疗组胃组织GSH水平升高，但差异均无统计学意义（p>0.05）。
　　4、DNA损伤产物8-OHdG的表达:免疫组化结果显示：8-OHdG主要定位于胞浆，在各组中均有不同程度表达。正常对照组及药物对照组8-OHdG表达主要为弱阳性，Hp模型组8-OHdG表达水平高于正常对照组,差异有统计学意义（p<0.05）；Hp+NAC干预组、Hp+NAC治疗组8-OHdG表达水平均较Hp模型组降低，差异有统计学意义(p<0.05)。
　　三、NAC对小鼠胃粘膜组织PI3K/Akt信号通路相关蛋白的表达影响
　　1、Western-Blot结果：总蛋白Akt和GSK3-β在各组间的表达均无统计学差异（p>0.05）；Hp模型组与正常对照组相比p-Akt和p-GSK3-β的表达增加，有显著统计学差异(p<0.01)；NAC药物对照组与正常对照组相比 p-Akt和p-GSK3-β的表达无统计学差异（p>0.05）；Hp+NAC干预组、Hp+NAC治疗组与 Hp模型组相比 p-Akt和 p-GSK3-β的表达均降低，有显著统计学差异(p<0.01）。
　　2.免疫组化结果：Akt、GSK3-β主要定位于胞浆，在各组中均有不同程度表达，但表达均不明显，各组表达评分均无明显差异（p>0.05)。p-Akt、p-GSK3-β主要定位于胞浆，在各组中均有不同程度表达。NAC药物对照组与正常对照组相比p-Akt、p-GSK3-β表达水平均无明显差异（p>0.05)；Hp模型组p-Akt、p-GSK3-β表达水平显著高于正常对照组(p<0.05)；Hp+NAC干预组、Hp+NAC治疗组p-Akt、p-GSK3-β表达水平均较Hp模型组降低，差异有统计学意义(p<0.05)。
　　结论：
　　通过动物实验证实：1、Hp感染Balb/c小鼠后，可使胃粘膜组织ROS生成增多，引起细胞脂质过氧化损伤及DNA损伤，同时可激活Akt信号通路；2、NAC可通过清除生成的ROS减轻脂质过氧化损伤及DNA损伤，也可抑制Akt信号通路的激活。