基于免疫磁分离和核酸适配子技术快速检测食源性致病菌的研究

摘要

食源性致病菌引发的食品安全问题对人类健康构成了严重威胁，全球急需建立监测体系，发展快速、特异和灵敏的检测方法来判知食源性致病菌对食物的污染，应对其危害。传统的食源性致病菌检测方法存在耗时、劳动强度大等缺点，不能满足现代食品工业对微生物实时监控的要求。目前，常用快速检测方法主要有：（1）基于分子生物学的方法；（2）基于特异性识别的方法。本文结合上述两类方法，建立了常见食源性致病菌（大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌和宋内氏志贺氏菌）的快检方法，分述如下：
　　（1）大肠杆菌O157:H7活菌的IMS-PMA-IAC-PCR检测体系的建立
　　采用免疫磁分离（IMS）技术捕获大肠杆菌O157:H7，叠氮溴化丙锭（PMA）处理大肠杆菌O157:H7，抑制细胞膜受损死菌DNA的PCR扩增，同时在PCR体系中加入一条扩增内标（ IAC），排除PCR抑制剂引起的假阴性结果，建立了大肠杆菌O157:H7活菌的IMS-PMA-IAC-PCR检测体系。结果表明：当大肠杆菌O157:H7菌体浓度从102 CFU/mL增到107 CFU/mL时，磁珠捕获效率从100％降到87%。PMA能够有效地抑制细胞膜受损的死菌DNA的PCR扩增。IMS-PMA-IAC-PCR方法在纯培养物中的检测限是2.1×102 CFU/mL；在人工污染的牛奶样品中则为5×103 CFU/mL。
　　（2）大肠杆菌O157:H7活菌的IMS-SD-PMA-qPCR检测体系的建立
　　进一步结合脱氧胆酸盐(SD)和PMA处理细菌，排除了死菌（细胞膜完整和细胞膜损伤）的干扰，建立了检测大肠杆菌O157:H7活菌的快速和灵敏的IMS-SD-PMA-qPCR方法。结果表明：SD处理细菌的最佳浓度和时间分别是0.1%（ m/v）和20 min。SD-PMA-qPCR方法与传统平板计数方法相比，具有相似活菌检测值，而qPCR和PMA-qPCR则具有较高的检测值。IMS-SD-PMA-qPCR方法在纯培养物中的检测限是101 CFU/mL，在加标的牛奶中则为102 CFU/mL。
　　（3）沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌活菌的SD-PMA-IAC-mPCR检测体系的建立
　　以沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌为研究对象，采用SD和PMA排除死菌（细胞膜完整和细胞膜损伤）DNA对PCR扩增的干扰，建立灵敏、准确的mPCR检测方法。经过参数优化，在纯培养物中沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的检测限分别为6.8×104、7.9×103和5.8×104 CFU/mL。经过15 h的预增菌，在加标牛奶或牛肉馅中则为101 CFU/mL。
　　（4）基于QCM传感器筛选鼠伤寒沙门氏菌核酸适配子方法的建立
　　QCM传感器是一种对质量非常敏感的检测仪器，具有筛选核酸适配子和同时追踪筛选过程中候选ssDNA库亲和力变化的能力。通过8轮正筛和2轮反筛，获得了三条候选核酸适配子序列A24、B5和B30。采用最佳核酸适配子B5，建立了基于核酸适配子的QCM方法，可在1 h内检测到103 CFU/mL的鼠伤寒沙门氏菌。
　　（5）基于免疫磁分离和核酸适配子PCR技术检测鼠伤寒沙门氏菌方法的建立
　　采用IMS技术从样品中捕获鼠伤寒沙门氏菌，再加入B5核酸适配子与鼠伤寒沙门氏菌进行孵育，回收结合在鼠伤寒沙门氏菌表面的核酸适配子，进行PCR扩增，建立了鼠伤寒沙门氏菌的快速和灵敏的检测方法。结果表明：免疫磁珠捕获菌体效率高达90%。该方法在纯培养物中的检测限为102 CFU/mL，在人工污染火鸡馅则为103 CFU/mL。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

缩略语索引

目录

第一章前言

1.1食源性致病菌

1.2食源性致病菌的检测方法

1.3核酸适配子研究概况

1.4研究内容

1.5研究目的与意义

第二章大肠杆菌O157:H7活菌的IMS-PMA-IAC-PCR检测体系的建立①

2.1前言

2.2材料与仪器

2.3实验方法

2.4实验结果

2.5讨论与分析

第三章大肠杆菌O157:H7活菌的IMS-SD-PMA-qPCR检测体系的建立②

3.1前言

3.2材料与仪器

3.3实验方法

3.4实验结果

3.5讨论与分析

第四章沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌活菌的SD-PMA-

4.1前言

4.2材料与方法

4.3实验方法

4.4实验结果

4.5分析与讨论

第五章基于QCM传感器筛选鼠伤寒沙门氏菌核酸适配子方法的建立④

5.1前言

5.2材料与仪器

5.3实验方法

5.4实验结果

5.5讨论与分析

第六章基于免疫磁分离和核酸适配子PCR技术检测鼠伤寒沙门氏菌方法的建立⑤

6.1前言

6.2材料与仪器

6.3实验方法

6.4实验结果

6.5分析与讨论

第七章结论与展望

7.1结论

7.2展望

致谢

附录A试剂

附录B实验仪器设备

参考文献

个人介绍

攻读学位期间研究成果