肠道微生物对肠道屏障影响的初步探究

摘要

肠道在消化吸收营养物质的同时，与肠道内大量微生物直接接触，给予微生物黏附和定植的空间位置，而肠道微生物在维系自身生长的同时，对肠道上皮细胞有着各种的刺激作用。大多肠道益生菌能够调节肠上皮细胞和树突状细胞的功能，从而调节机体健康，而多数食源性致病菌具有毒力，能够引起强烈的宿主反应。目前，益生菌和致病菌的种类很多，从菌体本身寻找共同的益生标记或致病标记，十分困难。通常益生菌促进了肠道结构的稳定而致病菌破坏肠道细胞，但肠道益生菌和致病菌对肠道作用涉及的信号通路较多，且具体的分子机制仍不清楚。故此，本论文选取常见的肠道微生物，探索它们对肠道屏障的影响，期望为建立评判益生菌或致病菌的方法提供依据。同时，为了更深一步挖掘每株细菌对肠上皮细胞其他基因转录水平的影响，借助转录组测序，尝试寻找益生菌与致病菌诱导肠道上皮细胞的差异表达基因。
　　首先，选用两种品系的小鼠肠道，检测肠道微生物对肠道屏障影响。结果表明，肠道益生菌（动物双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌）对Balb/c小鼠小肠完整性均有一定的维持能力，其蓝色葡聚糖2000渗透量相较于空白组在4 h时分别降低了3.14％、20.9%和33.5%；对于昆明鼠小肠效果更明显，下降59.9%、59.1%和55.5%。对于Balb/c小鼠，肠出血性大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和单核增生李斯特菌对肠道屏障具有明显的破坏能力，其蓝色葡聚糖2000的渗透量在4h时较对照组分别上升30.9%、61.1%和48.7%；但对昆明鼠小肠，肠出血性大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和单核增生李斯特菌处理后，其在2h时的渗透量分别上升50.8%、183.3%和102.6%，说明不同品系老鼠对肠道微生物的应答是不一样的。
　　利用细胞小室建立Caco-2肠上皮细胞间紧密连接结构模型，肠道细菌与其共孵育后，再分别通过测量跨膜电阻值和蓝色葡聚糖2000渗透量来判断菌体对紧密连接结构的影响。结果表明，动物双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌处理后，与对照相比，跨膜电阻值在6 h后分别提高了4.3%、4.3%和2.9%，表明其对紧密连接结构具有一定的维持能力，而肠出血大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和单核增生李斯特菌处理后，分别降低8.1%、8.2%和13.1%，表明其对紧密连接结构具有一定的破坏能力。实验选取的肠道细菌处理Caco-2单层膜模型后，蓝色葡聚糖渗透量都出现下降，动物双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌处理后6h后，蓝色葡聚糖2000相对渗透量分别下降7.9%，82.9%和46.2%；肠出血性大肠杆菌和单核增生李斯特菌处理后，蓝色葡聚糖2000的相对渗透量出现上升，达到13.7%和0.75%，而鼠伤寒沙门氏菌处理后，其渗透量下降0.51%。这样的结果也表明在肠道渗透性研究中，细胞模型并不能完全替代动物实验模型。通过荧光定量PCR技术，分析紧密连接结构主要的三种蛋白ZO-1、Claudin-1和Occludin的基因转录水平，并没有发现规律性变化。
　　为了进一步研究菌体对肠上皮细胞的影响，利用高通量测序技术，对菌体处理后的Caco-2细胞进行转录组测序，在数据过滤和处理之后，对所得到的数据进行分析。研究结果表明，益生菌组与致病菌组相比共有61差异表达基因，其中上调表达基因22个，下调表达基因39个。KEGG分析表明，这些基因主要富集于Toll样受体信号通路、蛋白内质网内加工、MAPK信号通路和肠道产IgA免疫网络等通路中。
　　本研究结果探索了肠道微生物对肠道屏障功能的影响，对临床胃肠疾病的辅助治疗、微生态制剂和发酵食品的开发和应用具有一定的参考价值，同时，也为分析、鉴定和区分肠道微生物益生性提供数据支持。

目录

声明

缩略语索引

第1章 引言

1.1 概述

1.2肠道菌群数量及其多样性

1.3肠道益生菌

1.4 肠道致病菌

1.5肠道微生物与肠道的相互作用

1.6肠道屏障

1.7本文的研究目的和内容

第二章 菌株对小鼠肠道渗透性影响

摘要

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.3 实验方法

2.4 结果与讨论

2.7 小结

第三章 菌株对肠上皮细胞间紧密连接的影响

摘要

3.1 前言

3.2 材料与方法

3.3 实验方法

3.4 结果与讨论

3.5 小结

第四章 菌株对Caco-2细胞转录水平的差异性分析

摘要

4.1 前言

4.2 材料与方法

4.3 实验方法

4.4 结果与讨论

4.5 小结

第五章 结论和建议

5.1 结论

5.2 建议

致谢

参考文献

附录A 仪器设备

附录B 试剂

附录C 常用试剂的配制

附录D 培养基的配制

个人介绍

攻读学位期间的研究成果