小儿骨碱性磷酸酶单克隆抗体及免疫层析试纸条的制备

摘要

骨碱性磷酸酶（Bone alkaline phosphatase,BAP）是一种骨代谢生化标志物。小儿骨碱性磷酸酶（Neonatal bone alkaline phosphatase,NBAP）含量的检测常被用来诊断、评估和筛查小儿佝偻病。高亲和性和高特异性的抗NBAP单克隆抗体对于建立NBAP的免疫学检测方法具有重要意义。
　　本文用NBAP作为免疫原免疫小鼠，从二免开始利用间接酶联免疫吸附法（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）连续监控小鼠血清的效价，五免后，小鼠血清的有效稀释倍数高达1,024,000倍。取小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）进行细胞融合，融合细胞群经HAT培养基筛选、ELISA筛选、细胞克隆等一系列过程后筛选出能够稳定分泌抗NBAP单克隆抗体的细胞株73株。从中选择细胞株制备腹水，共得到35种抗NBAP单克隆抗体腹水。将35种腹水用辛酸-硫酸铵法纯化，并用紫外分光光度法测定纯化后抗体的浓度。抗体的效价用间接ELISA法测定，结果表明几乎所有抗体的效价都大于10,000。细胞上清液、腹水和纯化后抗体的比较结果表明，在所选的38株细胞中，大多数细胞株具有良好的存活性能及遗传稳定性，能够产生腹水并稳定分泌出单克隆抗体。研究所得到的多株高亲和性的抗NBAP抗体，在NBAP的免疫学快速检测方法中有较好的应用前景。
　　研究进一步选取所纯化的11种单抗利用双抗夹心原理在试纸条上相互配对。挑选出配对结果较好的3株抗NBAP单克隆抗体（3-19-C8、3-12-B6和1-16-B2）用于NBAP胶体金免疫层析试纸条的制备。单抗3-12-B6和1-16-B2分别与胶体金标记，单抗（3-19-C8或者3-12-B6）和羊抗鼠IgG分别喷在硝酸纤维素膜（NC膜）上作为检测线（T线）和质控线（C线），分别建立了PBS缓冲液体系和人工血清体系中快速检测NBAP的胶体金免疫层析试纸条方法。NBAP胶体金试纸条的最佳实验条件如下：单抗3-12-B6和1-16-B2的最佳标记pH均为6；最佳标记量均为5μg/mL；金标抗体的喷量均为7μL/cm；单抗3-19-C8和3-12-B6在T线上的浓度均为2.0 mg/mL；单抗3-19-C8和3-12-B6、3-12-B6和1-16-B2所制备的试纸条的检测时间分别为15 min和10 min。在最佳实验条件下，NBAP最低检测限为：3-19-C8和3-12-B6、3-12-B6和1-16-B2所制备的试纸条在PBS
　　缓冲液体系中分别为5 pg/mL和10 pg/mL；在人工血清体系中分别为5 pg/mL和25 pg/mL。选取检测限更低的试纸条进行特异性实验和加标回收实验，特异性实验结果表明试纸条与成人骨碱性磷酸酶和肠碱性磷酸酶有较低的交叉率，与胎盘碱性磷酸酶无交叉反应，这一结果同时提示小儿和成人体内的BAP抗原表位可能存在一定差异。加标回收实验结果显示批内回收率为96.2％~108.6%；批间回收率为94.2%~101.0%，批内和批间的变异系数均小于15%。综上表明本文所建立的方法简单方便、灵敏特异、结果稳定，对于相关样本中NBAP的检测有良好的潜在应用前景。

目录

声明

缩略语表

第1章 前言

1.1 概述

1.2 骨代谢生化标志物的研究进展

1.3 BAP的概述

1.4 BAP检测的研究进展

1.5 胶体金免疫层析定量检测技术的研究进展

1.6 选题的目的及意义

第2章 抗NBAP单克隆抗体的制备

2.1 前言

2.2 材料与仪器

2.3 实验方法

2.4 实验结果

2.5 小结

第3章 抗NBAP单克隆抗体配对及胶体金免疫层析试纸条的制备

3.1 前言

3.2 材料与仪器

3.3 实验方法

3.4 结果与讨论

3.5 小结

第4章 结论与展望

4.1 结论

4.2 展望

致谢

参考文献

附录1 试剂

附录2 仪器设备

个人介绍

攻读学位期间的研究成果