与乳腺癌细胞共培养的成纤维细胞FSP-1的表达及对乳腺癌生长的影响

摘要

目的:
　　探索乳腺癌间质成纤维细胞对乳腺癌作用的分子机制，研究与人乳腺癌细胞共培养的人成纤维细胞特异蛋白-l(fibroblast-specific protein1，FSP-l)的表达及对乳腺癌生长的影响，为乳腺癌发生发展的机制研究提供新资料及为乳腺癌的分子靶向治疗提供实验依据。
　　方法
　　1.细胞培养和细胞共培养
　　细胞传代培养：人成纤维细胞系ESF和人乳腺癌细胞系MDA-MB-231分别放入含10％胎牛血清、100 U·mL－1青霉素和100μg·mL－1链霉素的DMEM-H培养基，在培养箱中培养，37℃，5%CO2，饱和湿度，细胞生长至80%～90%汇合时，进行传代培养。
　　细胞共培养：把接种了细胞的Transwell小室放到细胞已贴壁的培养板中进行ESF细胞和MDA-MB-231细胞共培养,通过同一培养液使两种细胞相互影响，接种在培养板的细胞用于各实验。
　　2. RT-qPCR
　　用Trizol试剂盒提取细胞总RNA，分光光度计检测提取的RNA；逆转录合成cDNA；q-PCR扩增反应,39个循环，熔解曲线64℃~94℃；实验结果由荧光定量PCR分析软件Bio-Rad CFX Manager自动进行统计和计算。
　　3. Western blot
　　洗涤和收集培养的细胞，细胞裂解液裂解细胞,4℃，30 min,4℃12000 rpm离心5 min，蛋白于-20℃保存；根据BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书配制不同浓度的蛋白标准品,绘制标准曲线；聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳（10%分离胶，5%浓缩胶）,每泳道20μg蛋白质,将蛋白转移至PVDF膜,一抗孵育4℃过夜,洗涤后加入二抗2h, ECL显色, Image J软件分析蛋白电泳条带光密度。
　　4.细胞增殖实验
　　采用CCK-8方法检测体外培养的MDA-MB-231细胞增殖，每组5个孔,分别检测第1-6天MDA-MB-231细胞增殖状况；按照CCK-8试剂盒的说明书,20μL CCK-8溶液/孔,培养箱内孵育2h,从每份样品中取100μL液体移至96孔板,放入酶标仪,450 nm波长处测定吸光值。
　　5．构建人乳腺癌裸鼠移植瘤模型
　　将6周龄的雌性裸鼠随机分为2组：ESF+MDA-MB-231组和MDA-MB-231组，每组16只。取100μL ESF细胞和MDA-MB-231细胞共培养的细胞悬液（细胞密度：2×106 MDA-MB-231细胞，1×106 ESF细胞）植入雌性裸鼠右侧胸壁乳腺内。接种后每隔1 d用游标卡尺测量瘤体的最长径(a)和最短径(b)，以肿瘤长径达5 mm为成瘤，根据公式计算肿瘤体积。第30天将裸鼠颈椎脱臼处死，肿瘤组织块10%甲醛固定，苏木精和伊红染色(HE染色)观察肿瘤组织的一般状况，免疫荧光观察肿瘤组织FSP-1的表达。
　　6.免疫荧光激光共聚焦显微镜检测
　　荷瘤裸鼠肿瘤组织10%甲醛溶液中固定，切片脱蜡后进行免疫荧光实验。二甲苯脱蜡，乙醇脱苯，组织放入0.01 M枸橼酸缓冲液（pH6.0）中微波修复抗原，1%BSA37℃封闭30 min，一抗4℃孵育过夜，荧光二抗37℃避光孵育60 min， DAPI室温染细胞核10 min，激光共聚焦显微镜下观察，拍照, Image-Pro Plus软件分析荧光强度。
　　7.免疫组织化学实验
　　切片脱蜡，3%H2O237℃孵育10min,抗原修复，一抗孵育过夜，二抗37℃孵育10min，DAB溶液显色，苏木素染核，脱水、透明、封片，Image J软件分析镜下图像。
　　8.统计学方法
　　SPSS Statistics17.0软件处理实验数据，实验结果用mean±SD表示，2组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义，P＞0.05为差异无统计学意义。
　　结果:
　　1.与MDA-MB-231细胞共培养的ESF细胞FSP-1表达上调
　　ESF＋MDA-MB-231共培养组的第2、3、4天ESF细胞FSP-1 mRNA水平显著高于ESF单独培养组(P＜0.05)，共培养的第3天ESF细胞FSP-1 mRNA水平达高峰，与共培养的第2天ESF细胞FSP-1 mRNA表达比较差异有统计学意义（P＜0.05）,共培养的第4天ESF细胞与共培养的第3天ESF细胞FSP-1 mRNA表达比较差异无统计学意义（P＞0.05）。
　　ESF＋MDA-MB-231共培养组的第2、3、4天ESF细胞FSP-1蛋白表达显著高于ESF单独培养组(P＜0.05)，ESF＋MDA-MB-231共培养组的第3天和第4天ESF细胞FSP-1蛋白的表达高于共培养组的第2天(P＜0.05)，共培养的第4天与共培养组的第3天FSP-1蛋白表达的差异无统计学意义（P＞0.05）。
　　上述结果表明，乳腺癌细胞与成纤维细胞共培养的微环境可上调成纤维细胞FSP-1的表达，在共培养的第4天成纤维细胞FSP-1的表达趋于稳定。
　　2.与人成纤维细胞ESF共培养的人乳腺癌细胞MDA-MB-231表达FSP-1 ESF＋MDA-MB-231共培养组的第2、3天和第4天MDA-MB-231细胞表达FSP-1mRNA与MDA-MB-231单独培养组比较差异有统计学意义（P＜0.05），共培养的第3、4天MDA-MB-231细胞表达FSP-1 mRNA与共培养的第2天比较差异有统计学意义（P＜0.05），共培养组MDA-MB-231细胞表达FSP-1mRNA第3天与第4天比较差异无统计学意义（P＞0.05）。
　　MDA-MB-231单独培养组未检测到FSP-1蛋白表达，ESF＋MDA-MB-231共培养组第3、4天MDA-MB-231细胞表达FSP-1蛋白显著高于共培养组第2天（P＜0.05），共培养第4天MDA-MB-231细胞FSP-1蛋白表达与共培养组第3天比较差异无统计学意义（P＞0.05）。
　　上述结果显示，乳腺癌细胞与成纤维细胞共培养的微环境可诱导乳腺癌细胞表达FSP-1,提示上皮肿瘤类型的乳腺癌细胞发生了上皮-间质细胞表型的转化（Epithelial-mesenchymal transition, EMT）。
　　3.体外共培养的人乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖上调
　　ESF＋MDA-MB-231共培养组MDA-MB-231细胞增殖速度在第2天至第6天显著快于MDA-MB-231单独培养组（P＜0.05），共培养组的MDA-MB-231细胞第2天至第5天呈现快速增殖，第3天快速增殖尤为显著，共培养组的MDA-MB-231细胞第3天的增殖活力显著高于其它时间段(P＜0.05)。
　　4.乳腺癌细胞与成纤维细胞共生长的裸鼠移植瘤组织高表达FSP-1并促进移植瘤生长
　　免疫荧光激光共聚焦显微镜观察结果显示ESF＋MDA-MB-231组的荷瘤裸鼠移植瘤组织高表达FSP-1,但MDA-MB-231组的荷瘤裸鼠移植瘤组织FSP-1表达较弱，说明人乳腺癌细胞和人成纤维细胞共同植入裸鼠乳腺内所形成的癌组织FSP-1的表达高于人乳腺癌细胞单一植入（P＜0.05）。
　　ESF+MDA-MB-231组的荷瘤裸鼠移植瘤体积显著大于MDA-MB-231组（P＜0.05），表明肿瘤基质成纤维细胞及高表达FSP-1能促进肿瘤生长。
　　5.临床人乳腺癌组织高表达FSP-1
　　人乳腺癌组织与人非乳腺癌组织免疫组化结果显示，人乳腺癌组织表达FSP-1，而人非乳腺癌组织FSP-1表达低或不表达。
　　结论:
　　1.体外人乳腺癌细胞和人成纤维细胞共培养微环境可上调成纤维细胞表达FSP-1并促进乳腺癌细胞增殖。
　　2.体外人乳腺癌细胞和人成纤维细胞共培养微环境可诱导乳腺癌细胞表达FSP-1。
　　3.荷瘤裸鼠的人乳腺癌细胞和人成纤维细胞共生长的移植瘤组织高表达FSP-1并促进裸鼠移植瘤生长。
　　4.临床人乳腺癌组织表达FSP-1，而人非乳腺癌组织FSP-1表达低或不表达。

目录

声明

中英文缩略词表

第1章 引言

第2章 材料与方法

2.1 材料

2.2 细胞培养和共培养

2.3 RT-qPCR

2.4 免疫印迹实验（Western blot）

2.5 细胞增殖实验

2.6构建人乳腺癌裸鼠移植瘤模型

2.7 免疫荧光激光共聚焦显微镜检测实验

2.8 免疫组化

2.9 统计学处理

第3章 实验结果与分析

3.1 与MDA-MB-231细胞共培养的ESF细胞FSP-1表达上调

3.2 与人成纤维细胞ESF共培养的人乳腺癌细胞MDA-MB-231表达FSP-1

3.3 体外共培养的人乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖上调

3.4 荷瘤裸鼠人乳腺癌细胞与人成纤维细胞共生长的移植瘤组织高表达FSP-1并促进肿瘤生长

3.5 人乳腺癌组织高表达FSP-1

第4章 讨论

第5章 结论

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述:FSP-1的研究进展