HedgeHog信号通路和EMT相关LncRNAs在瘢痕疙瘩中的表达研究

摘要

目的： 现有研究证实，Hedgehog（HH）信号通路和上皮间质转化（EMT）在胚胎发育、细胞增殖分化及肿瘤和纤维化性疾病的发生发展过程中均发挥了重要的作用。近期研究发现，它们在病理性瘢痕中也有异常改变，但其具体作用及分子机制尚待阐明。我们课题组前期研究显示，与信号通路密切相关的长链非编码RNA（lncRNAs）在病理性瘢痕中的表达谱发生了明显变化。本文在此基础上采用芯片探求筛选瘢痕疙瘩与正常皮肤组织中Hedgehog信号通路和EMT相关的lncRNAs和mRNAs的差异表达，并进行一系列生物信息学分析。从新的角度探讨瘢痕疙瘩形成的分子机制。为进一步寻找其在临床治疗新靶点提供新思路和理论基础。 方法： 分别取整形手术切除的瘢痕疙瘩表皮和邻近的正常皮肤表皮，采用Trizol法提取总RNA并进行质检。 (1)质检合格后，纯化并进行荧光标记、Arraystar人类LncPathTM Hedgehog芯片(8x15K)杂交，然后扫描得到杂交图片，利用Agilent Feature Extraction v11.0.1.1软件处理，用AgilentGeneSpring GX v12软件进行数据分析并检测与Hedgehog信号通路相关的lncRNAs和mRNAs差异表达谱。分别挑选与HH信号通路相关的上调lncRNA：LOC100271722，下调lncRNA：HNF1A-AS1；相关的上调mRNA：SFRP2、WNT7B、HNF1A，下调mRNA：WIF1，以GAPDH作为内参，行荧光定量PCR验证。对差异表达的mRNAs采用 DAVID Bioinformatics Resources6.7进行基因本体（ GO）、生物学通路（Pathway）功能注释聚类分析，获得差异mRNA相关功能的功能富集类。 （2）质检合格后，纯化并进行荧光标记、Arraystar人类LncPathTM EMT芯片(8x15K)杂交，然后扫描得到杂交图片，利用Agilent Feature Extraction v11.0.1.1软件处理，用AgilentGeneSpring GX v12软件进行数据分析并检测与EMT信号通路相关的lncRNAs和mRNAs差异表达谱。分别挑选与EMT相关的上调lncRNA：AK055628、NR_033321，下调lncRNA：ENST00000399188；相关的上调mRNA：ENST00000304636、NM_006475，下调：NM_053056，以GAPDH作为内参，行荧光定量PCR验证芯片结果的可靠性。结合以往文献报道及各数据库，对差异表达的lncRNA进行亚类分析及靶基因预测。 结果： （1）筛选出与Hedgehog信号通路相关的30条lncRNAs和33条mRNAs存在差异表达。与正常皮肤表皮组织比较，在瘢痕疙瘩表皮组织中明显上调LncRNAs有16条，主要有：AK055628、MIAT、MIR31HG、RP11-264F23.3、AC073257.2等；明显下调lncRNAs14条，主要有：RP11-12M9.3、XLOC_007437、XLOC_009485、RP5-1042I8.7、HNF1A-AS1等。明显上调mRNAs13条，主要有：SFRP2、ANGPT2、APC2、IVL、GLI2等；明显下调mRNAs20条，主要有：WIF1、KRT1、CCND1、BCL2、NOTCH2等。qPCR验证结果与芯片检测结果一致。GO分析和KEGG通路分析结果表明上调的mRNAs参与了细胞增殖、生长及组织重建，下调的mRNAs参与了细胞死亡、凋亡等生物学过程。其中在瘢痕疙瘩表皮组织中lncRNA AC073257.2及其靶基因Gli2均上调，通过Arraystar lncRNA数据库预测调控（对差异表达的lncRNAs和靶基因mRNAs之间的相关关系进行注释）提示lncRNA AC073257.2可能具有增强子的功能特性，可在转录水平上正调控其上游靶基因Gli2的表达从而影响细胞的生长和增殖；在瘢痕疙瘩表皮组织中HNF1A-AS1下调而其靶基因HNF1A上调，lncRNA HNF1A-AS1可能在转录或转录后水平负调控其邻近靶基因HNF1A的表达，从而影响瘢痕疙瘩的生长。 （2）筛选出与EMT相关的lncRNAs26条和mRNAs39条存在差异表达，与正常皮肤表皮组织比较，在瘢痕疙瘩表皮组织中明显上调LncRNAs有9条，主要有：uc001gch.1、AK055628、NR_033321等，明显下调lncRNAs17条主要有：ENST00000399188等；明显上调mRNAs17条，主要有：ENST00000304636、NM_004126、NM_006475等，明显下调mRNAs22条，主要有：NM_053056等。qPCR验证结果与芯片检测结果具有较好的一致性。lncRNAENST00000379816可能通过碱基互补配对或者顺式作用，调控其邻近靶基因MT1B，从而参与上皮增殖分化作用；LncRNA ENST00000399188和ENST00000454001可分别充当EP300与LATS2的增强子，干预邻近蛋白编码基因启动子的转录，从而调控细胞增殖、迁徙及上皮间质转化；lncRNA ENST00000573934可通过竞争性内源性机制结合miRNA，调控其靶基因ETS1、HDAC3、PCBP1和EPB41L5的表达，从而参与调控瘢痕疙瘩表皮EMT过程。 结论： （1）人瘢痕疙瘩组织与正常皮肤组织比较，与Hedgehog信号通路相关的lncRNAs与mRNAs有明显差异性表达；与EMT相关的lncRNAs与mRNAs有明显差异性表达，可能与瘢痕疙瘩的发生发展及转归密切相关。 （2）在瘢痕疙瘩组织中上调的lncRNA AC073257.2具有增强子的功能特性，可能在转录水平上正调控其上游靶基因Gli2的表达；下调的HNF1A-AS1可能在转录或转录后水平负调控其邻近靶基因HNF1A的表达。 （3）在瘢痕疙瘩组织中上调的lncRNA ENST00000379816可能通过碱基互补配对或者顺式作用，调控其邻近靶基因MT1B，从而参与上皮增殖分化；下调的LncRNA ENST00000399188和 ENST00000454001可分别充当EP300与LATS2的增强子，干预邻近蛋白编码基因启动子的转录，从而影响细胞增殖、迁徙及上皮间质转化；上调的lncRNA ENST00000573934可能通过竞争性内源性机制结合miRNA，调控其靶基因ETS1、HDAC3、PCBP1和EPB41L5的表达。 （4）差异表达的lncRNAs可能通过影响临近蛋白编码基因表达、充当增强子或者竞争性内源等机制，参与瘢痕疙瘩Hedgehog信号通路和EMT变化，从而导致瘢痕疙瘩的形成和演化。其详细作用及其分子机制尚待深入探讨和阐明。

目录

声明

英文缩写及中英文对照表

前言

第一部分 瘢痕疙瘩中与Hedgehog信号通路相关lncRNAs的表达谱分析

1 材料与方法

1.1 研究标本

1.2 实验试剂与仪器

2 实验方法

2.1 组织总RNA的提取与分离

2.2 检测RNA质量

2.3 基因芯片分析、图像采集和数据分析

2.4 qRCR法验证 LncRNAs 芯片检测结果的可靠性

2.5 统计学分析

3 结果

3.1 RNA质检结果

3.2 组织HE染色结果及杂交图

3.3靶基因的GO分析

3.4靶基因的KEGG生物通路富集分析

3.5 qPCR验证

4 讨论

5 结论

第二部分 瘢痕疙瘩中与上皮间质转化相关LncRNAs的表达研究

1 材料与方法

1.1 研究标本

1.2 实验试剂与仪器

2 实验方法

2.1 组织总RNA的提取与分离

2.2 检测RNA质量

2.3 基因芯片分析、图像采集和数据分析

2.4 qRCR法验证 LncRNAs 芯片检测结果的可靠性

2.5 统计学分析

3 结果

3.1 RNA质检结果

3.2 芯片杂交结果

3.3 差异表达lncRNA及其潜在靶向mRNA分析

3.4 qPCR验证结果

4 讨论

5 结论

全文小结

参考文献

致谢

攻读学位期间的研究成果

综述:瘢痕疙瘩的治疗进展