蛹虫草Cmfrq、Cmwc-1和Cmwc-2基因表达调控、抗体制备及蛋白表达检测

摘要

生物体内都存在自身能够控制生理节律的生物钟。生物钟蛋白FRQFREQUENCY（FRQ）、蓝光受体White Colar-1（WC-1）和White Colar-2（WC-2）是真菌生物钟系统中核心振荡器的三个重要成分，它们在生物钟负反馈调节系统中发挥着非常重要的作用。本论文以蛹虫草（Cordyceps militaris） F411为实验材料，对蛹虫草中生物钟基因Cmfrq（Cordyceps militaris frq）、蓝光受体基因Cmwc-1（Cordyceps militaris wc-1）和Cmwc-2（Cordyceps militaris WC-2）的表达调控进行了分析，制备了生物钟蛋白CmFRQ（Cordyceps militaris FRQ）、蓝光受体CmWC-1（Cordyceps militaris WC-1）和CmWC-2（Cordyceps militaris WC-2）的抗体，并用制备的抗体对蛹虫草中的蛋白表达情况进行Western blotting检测。
　　为了研究Cmfrq、Cmwc-1和Cmwc-2的表达调控情况，本实验设计了不同的蛹虫草培养条件，利用实时荧光定量 PCR技术检测不同条件下的 Cmfrq、Cmwc-1和Cmwc-2的表达。结果表明，在不同条件下Cmfrq、Cmwc-1和Cmwc-2的表达不同。Cmfrq基因相对表达量最高，Cmwc-2基因其次，Cmwc-1基因最低。当蛹虫草菌丝体从黑暗条件下转入到光照条件下时，frq基因的转录水平都会上升，这种现象与粗糙脉胞菌中相同。畸形子实体比正常的子实体存在一个更高的Cmfrq表达量。但蛹虫草中Cmwc-1和Cmwc-2基因表达量的差异，预示着蛹虫草中复合体结构可能不同于粗糙脉孢菌中的WCC结构。Cmwc-1的表达主要集中在子实体的中下段部分，而 Cmwc-2的表达集中在在子实体的顶端和中段部分，这表明在子实体的中间部分可能会更多地形成CmWC-1/CmWC-2复合体结构，这种现象推测与子实体的向光性和伸长有关。
　　通过生物信息学分析，设计引物对Cmfrq部分序列（1561-2727 bp）、Cmwc-1部分序列（1549-2772 bp）和Cmwc-2部分序列（394-1179 bp）进行PCR扩增。将目的片段与质粒pET-41a(+)连接后，转化到BL21（DE3）感受态细胞，然后用IPTG进行诱导表达。表达成功的融合蛋白分子量大小分别为74 kDa、76 kDa和64 kDa。所有的表达蛋白经过纯化后用作抗原，制备出了抗体anti-CmFRQF、anti-CmWC-1A和anti-CmWC-2B。CmFRQ蛋白还采用了另外一种方法制备抗体，首先化学合成三条CmFRQ抗原决定簇短肽FRQ1、FRQ2和 FRQ3，偶联载体蛋白后作为抗原制备抗体anti-FRQ1、anti-FRQ2和anti-FRQ3。
　　分别提取蛹虫草菌丝体和子实体的总蛋白，用制备的抗体进行 Western blotting分析。结果表明，anti-FRQ2始终可以检测到蛹虫草菌丝体和子实体中特异的50 kDa（CmFRQ50）和31 kDa（CmFRQ31）蛋白质杂交带。在子实体中在40 kDa和50 kDa之间还存在两条杂交带。此外，菌丝体和子实体的不同生长时期，CmFRQ50和 CmFRQ31蛋白质相对含量会出现变化，表明生物钟蛋白 CmFRQ的存在形式可随着蛹虫草的生物学性状变化而发生变化。anti-CmFRQ在 Western blotting中可检测到菌丝体中的 CmFRQ100，但CmFRQ100在子实体中不能检测到。CmWC-1在菌丝体和子实体中存在不同的形式：菌丝体中存在CmWC1-42和CmWC1-48两种形式，而在子实体中只存在CmWC1-42一种形式，推测CmWC1-48含有LOV结构域。蛹虫草F411的CmWC-2在菌丝体和子实体中存在相同的形式CmWC2-50。
　　本研究初步分析了Cmfrq、Cmwc-1和Cmwc-2的表达调控关系，并检测了CmFRQ、CmWC-1和CmWC-2在蛹虫草中的存在形式，这对进一步研究蛹虫草的生物钟系统提供了依据。

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1 前言

1.1蛹虫草简介

1.2生物钟系统概述

1.2.1生物钟系统简介

1.2.2 WC-1和WC-2

1.2.3 FRQ

1.2.4生物钟负反馈调控环路模型

1.3相关研究现状

1.4本研究的目的和意义

2 蛹虫草Cmfrq、Cmwc-1和Cmwc-2基因表达调控

2.1 实验材料

2.1.1 实验菌种

2.1.2 实验试剂

2.1.3 实验仪器

2.1.4 培养基的配制

2.1.5引物设计

2.2 实验方法

2.2.1 蛹虫草的培养及取样

2.2.2 蛹虫草菌丝体和子实体总RNA的提取

2.2.3 RNA反转录

2.2.4 蛹虫草Cmfrq、Cmwc-1和Cmwc-2基因Real Time PCR

2.2.5 Real Time PCR反应数据处理

2.3实验结果及分析

2.3.1蛹虫草菌丝体和子实体总RNA的提取

2.3.2 Cmfrq、Cmwc-1和Cmwc-2基因在菌丝体中相对表达分析

2.3.3 Cmfrq、Cmwc-1和Cmwc-2基因在子实体中相对表达结果及分析

2.4本章小结

3 蛹虫草CmFRQ、CmWC-1和CmWC-2抗体制备及表达蛋白检测

3.1 实验材料

3.1.1实验菌株和表达载体

3.1.2实验试剂

3.1.3 主要仪器

3.1.4 培养基的配制

3.1.5 溶液的配制

3.1.6 引物设计

3.2 实验方法

3.2.1 Cmfrqf、Cmwc-1a和 Cmwc-2b的原核表达

3.2.2抗体制备

3.2.3蛹虫草总蛋白的Western blotting分析

3.3 实验结果及分析

3.3.1 Cmfrqf、Cmwc-1a和 Cmwc-2b的原核表达

3.3.2 抗体制备

3.2.3 蛹虫草总蛋白的Western blotting分析

3.4本章小结

4 总结

参考文献

附录

致谢

在读期间公开发表论文（著）及科研情况