蛹虫草CmWC-1、CmWC-2基因的序列分析和蓝光诱导表达

摘要

蛹虫草是一种重要的药食两用真菌，富含多种生理活性成分包括虫草多糖、虫草素等。而蓝光作为一种能影响真菌光受体的环境信号，能调控多种生物生长及生理学过程。本研究试图通过分子生物学研究进一步了解蓝光对蛹虫草功能基因表达的诱导，为挖掘蛹虫草的功能基因宝贵资源提供支持。本研究得到的主要结果如下:
　　 (1)通过3'RACE法得到蛹虫草潜在蓝光受体基因CmWC-1、CmWC-的3'端部分序列。测序结果表明CmWC-1基因3'端部分片段长度为1020bp，其中394-452bp为内含子;CmWC-2基因3'端序列共1009bp，其中288-353bp为内含子。
　　 (2)通过PCR得到CmWC-1、CmWC-2基因开放阅读框(ORF)序列，全长分别为2823bp和1575bp。序列分析表明CmWC-1基因ORF翻译后氨基酸序列长度为940aa，推测此蛋白为GATA型锌指结合蛋白，包含3个PAS功能域（一个特殊类型PAS域又被称为LOV域）和一个锌指结构功能域。CmWC-2基因ORF翻译后氨基酸序列长度为525aa，推测此蛋白为Cutinasepalindrome-bindingprotein(PBP)蛋白，包含1个PAS功能域。
　　 (3)根据已得到CmWC-1、CmWC-2基因ORF序列设计引物，通过PCR得到CmWC-1、CmWC-2基因ORF部分功能域片段，与pEASY-E1ExpressionVector进行连接后导入到Trans-T1受体细胞中。将阳性重组子振荡培养后提取质粒，导入到BL21(DE3)受体细胞中，挑取阳性重组子进行菌落PCR鉴定和测序分析，完成CmWC-1、CmWC-2基因ORF部分功能域原核表达载体的构建。CmWC-1基因部分功能域表达序列从开放阅读框(ORF)第844个核苷酸开始表达，表达全长为1266bp，共计表达433个氨基酸;CmWC-2基因部分功能域表达序列从开放阅读框(ORF)第286个核苷酸开始表达，表达全长为636bp，共计表达212个氨基酸。
　　 (4)通过实时荧光定量PCR(Real-TimeQuantitativePCR)对蛹虫草潜在蓝光受体基因CmWC-1、CmWC-2基因在蓝光诱导下表达量变化进行研究，结果表明CmWC-1、CmWC-2基因在有无蓝光诱导的条件下均有一定量的表达，其中在黑暗培养条件下，CmWC-1基因相对表达量最高，达到0.44;蓝光诱导条件下，在16h处出现相对表达量峰值0.37。与CmWC-1基因不同，CmWC-2基因在蓝光诱导16h时相对表达量达到峰值3.28，黑暗和其他蓝光诱导时间段表达量均比较低。这表明蓝光的直接照射可以导致.CmWC-1和CmWC-2基因表达水平的改变。

目录

声明

摘要

1．引言

1．1 蛹虫草及其分子生物学研究进展

1．1．1 蛹虫草保守基因

1．1．2 蛹虫草其它功能基因

1．2 蓝光受体WC-1和WC-2蛋白结构及其功能

1．2．1 WC-1和WC-2蛋白及其功能

1．2．2 WC-1和WC-2蛋白的结构

1．3 PAS功能域结构及其功能

1．3．1 PAS功能域及其功能应用

1．3．2 PAS功能域的结构

1．4 本论文的研究意义

2．蛹虫草CmWC-1基因的序列分析及蓝光影响的表达

2．1 实验材料及试剂

2．1．1 实验材料

2．1．2 主要仪器

2．1．3 主要培养基的配制

2．1．4 溶液的配制

2．1．5 引物设计

2．2 实验方法

2．2．1 蛹虫草菌丝体的蓝光诱导培养及取样

2．2．2 蛹虫草菌丝体总RNA的提取

2．2．3 DNA消化

2．2．4 RNA反转录

2．2．5 CmWC-1基因3′端部分序列获得及测序

2．2．6 CmWC-1基因开放阅读框(ORF)的获得及测序

2．2．7 CmWC-1基因ORF部分功能域原核表达载体的构建及检测

2．2．8 实时荧光定量PCR测定蓝光诱导下CmWC-1基因表达量变化

2．3 实验结果及分析

2．3．1 蛹虫草总RNA提取

2．3．2 CmWC-1基因3′端部分序列PCR及测序分析

2．3．3 CmWC-1基因ORF序列PCR及测序分析

2．3．4 CmWC-1基因ORF部分功能域原核表达载体构建及检测

2．3．5 实时荧光定量PCR测定蓝光诱导下CmWC-1基因表达量变化

2．4 本章小结

3．蛹虫草CmWC-2基因的序列分析及蓝光影响的表达

3．1 实验材料及试剂

3．1．1 实验材料

3．1．2 主要仪器

3．1．3 主要培养基的配制

3．1．4 溶液的配制

3．1．5 引物设计

3．2 实验方法

3．2．1 蛹虫草菌丝体的蓝光诱导培养及取样

3．2．2 蛹虫草菌丝体总RNA的提取

3．2．3 DNA消化

3．2．4 RNA反转录

3．2．5 CmWC-2基因3′端部分序列获得及测序

3．2．6 蛹虫草CmWC-2基因开放阅读框(ORF)的获得及测序

3．2．7 CmWC-2基因ORF部分功能域原核表达载体的构建及检测

3．2．8 实时荧光定量PCR测定蓝光诱导下CmWC-2基因表达量变化

3．3．实验结果及分析

3．3．1 蛹虫草总RNA提取

3．3．2 CmWC-2基因3′端部分序列PCR及测序分析

3．3．3 CmWC-2基因ORF序列PCR及测序分析

3．3．4 CmWC-2基因ORF部分功能域原核表达载体构建及检测

3．3．5 实时荧光定量PCR测定蓝光诱导下CmWC-2基因表达量变化

3．4 本章小结

讨论

参考文献

致谢

在读期间公开发表论文(著)及科研情况