西尼罗河病毒E蛋白结构域Ⅲ的原核表达及其特异性单克隆抗体的研制

摘要

西尼罗河病毒(WNV)在病毒学分类上属于黄病毒科黄病毒属日本脑炎病毒血清群，因于1937年首次从非洲乌干达西尼罗河地区一名发热的妇女血液中分离到病毒而得名。自然条件下，病毒存在于鸟—蚊子—鸟的传播循环中，其中以库蚊为主。人、马经带毒蚊虫的叮咬而感染，引发西尼罗河热或西尼罗河病毒性脑炎。 根据已发表的序列，设计合成一对针对NY99株西尼罗河病毒E蛋白结构域Ⅲ基因序列的特异性引物，以引进的含WNVE蛋白基因的重组质粒为模板，用聚合酶链式反应(PCR)扩增WNVE蛋白结构域Ⅲ的基因，大小为360bp。将PCR产物克隆入pGEM-T载体，构建了重组质粒pGEM-T/DⅢ，经BamHI和HindⅢ限制性内切酶双酶切，回收目的片段，克隆到pET-32a表达载体。通过PCR、酶切及测序鉴定证实结构域Ⅲ基因以正确的阅读框架插入了pET-32a载体。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导后，运用SDS-PAGE电泳分析表达产物并用WesternBlot进行鉴定，结构域Ⅲ融合蛋白的相对分子质量约为30.3×103。亲和层析法从表达产物中纯化目的蛋白，从而为制备WNV实验室诊断抗原和分析结构域Ⅲ的基因结构与功能的关系奠定了基础。 以纯化的西尼罗河病毒E蛋白结构域Ⅲ重组融合蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠，运用淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合，并采用间接ELISA方法进行筛选，共获得了3株能稳定分泌针对西尼罗河病毒E蛋白结构域Ⅲ的特异性单抗的杂交瘤细胞株，分别命名为4F7、6H3和8E4，其单抗亚类鉴定分别属于IgG1、IgG1和IgG2a。经间接ELISA、免疫印迹和间接免疫荧光试验鉴定，这3株单克隆抗体均能与重组西尼罗河病毒E蛋白结构域Ⅲ发生特异性反应，而与日本脑炎病毒无交叉反应，并且，8E4和6H3识别同一抗原位点，4F7识别西尼罗河病毒E蛋白结构域Ⅲ的另一抗原位点。本实验成功研制出针对西尼罗河病毒E蛋白结构域Ⅲ的特异性单克隆抗体，为我国建立西尼罗河病毒的病原学检测方法并与日本脑炎病毒进行鉴别诊断提供了有力的技术贮备。

目录

摘要

符号说明

综述：西尼罗河病毒研究进展

第一部分西尼罗河病毒E蛋白结构域Ⅲ在大肠杆菌中的表达及纯化

第二部分西尼罗河病毒E蛋白结构域Ⅲ特异性单克隆抗体的研制

总结

参考文献

致谢

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