siRNA对类风湿关节炎相关的HLA-DRB10405基因表达的抑制作用

摘要

类风湿关节炎(RA)的易感性与人类白细胞抗原(HLA)-DR1和HLA-DR4(均属HLA-DRB1)的等位基因亚型密切相关。国内外学者的研究表明，干扰RA相关性HLA-DRB1的作用可以抑制HLA-DRB1介导的异常免疫反应。RNA干扰(RNAi)是由双链RNA分子介导的序列特异性抑制同源基因表达的技术。引用RNAi机制沉默HLA-DRB1特定基因，可为RA的治疗提供新的思路。 由于我国、日本及韩国等亚洲国家RA患者主要与HLA-DRB1*0405基因呈强相关性，研究抑制该基因的特异性小干扰RNA(smallinterferingRNA，siRNA)可以为我国RA患者的治疗提供试验依据。本研究设计了6条针对HLA-DRB1*0405基因的shRNA和一条随机对照的shRNA，分别克隆到psiLentGene-2载体中。同时构建荧光素酶/HLA-DRB1*0405重组质粒。用脂质体共转染两种重组质粒到人胚胎肾细胞(HEK-293)，通过实时荧光定量PCR和荧光素酶强度检测分析293细胞中HLA-DRB1*0405基因mRNA的水平。 研究结果表明，设计的6条siRNA可不同程度抑制293细胞中HLA-DRB1*0405基因的mRNA表达水平，实时荧光定量PCR的研究结果表明，其基因沉默效率最高可达89.25％，荧光素酶强度检测的结果表明，其基因沉默效率达46.70％，而对照组siRNA没有RNAi作用。根据结果筛选得到具有显著干扰作用的siRNA1和siRNA3。通过HLA-DR亚型分析，确立HLA-DRB1*0405基因型RA患者。通过流式细胞术研究siRNA1和siRNA3对RA患者外周血单个核细胞(PBMC)表面HLA-DRB1*0405基因表达的抑制作用。结果表明siRNA1试验组和siRNA3试验组的PBMC细胞HLA-DRB1*0405蛋白表达阳性率分别为60.45％和54.67％，皆显著低于对照siRNA试验组的98.41％和非RNAi试验组的99.57％。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

第一章文献综述

第二章HLA-DRB1*0405表达载体的构建

第三章HLA-DRB1*0405基因siRNA的设计及其小茎环RNA表达载体的构建

第四章HLA-DRB1*0405基因siRNA的筛选

第五章siRNA对类风湿关节炎患者外周血单个核细胞中HLA-DRB1蛋白的作用

第六章结论

致谢