乳酸菌胞外多糖生物合成及提高免疫力的研究

摘要

本研究主要内容为高产胞外多糖(exopolysaccharide,EPS)乳酸菌的筛选、培养基的确定、培养条件的优化及乳酸菌胞外多糖在增强免疫功能方面的作用。另外，利用干酪在加工过程中的副产物乳清来合成胞外多糖。 以发酵乳制品、酸菜、泡菜等为样品，进行了乳酸菌菌种的活化、分离、纯化，共分离到乳酸菌20株。对分离到的乳酸菌进行胞外多糖高产菌株的筛选，结果筛选出植物乳杆菌为高产EPS的乳酸菌。 根据多糖的产量，从MRS、ATP、SL、Eiller培养基中选择高产胞外多糖的Eiller培养基作为植物乳杆菌合成EPS的基本培养基。并对碳源、氮源、盐等对该菌株EPS生物合成的影响进行了研究。从而开发出用于植物乳杆菌EPS生物合成研究的新型合成培养基(命名为E1)，该培养基的组成为：普通蛋白胨13.3g、蔗糖13.3g、葡萄糖13.3g、酵母提取物5.0g、氯化钠4.0g、明胶2.5g、乙酸钠1.5g、抗坏血酸0.5g、去离子水1000mL。 选择适当的培养条件，根据单因素实验结果设计L9(34)正交试验，确定最佳发酵条件为：初始pH为5.2，45℃发酵22h，。粗多糖含量为881.90mg/L。 经提取的粗多糖，依次经DEAE-52纤维素层析和SephadexG-100凝胶层析分离，样品浓度10mg/ml，上样量为3ml，流速15ml/h，3ml/管分部收集，用凝胶柱层析法测得EPS I的平均分子量为EPS I的分子量为1.5×105，EPS H的分子量为1.1×104。 急性毒性实验表明，植物乳杆菌EPS安全无毒。动物实验结果表明：与NS组相比，多糖组可以显著提高小鼠脾脏、胸腺的重量和吞噬指数(P<0.05或P<0.01)，表明EPS可以促进非特异性免疫功能；粗多糖高剂量组可以可使小鼠足跖肿胀度明显增加，差异具有显著性(P<0.05或P<0.01)，表明EPS对小鼠的细胞免疫功能有促进作用；纯多糖高剂量组和粗多糖高、低剂量组可以显著的降低小鼠的血清溶血值(P<0.05或P<0.01)，表明EPS可增强体液免疫功能；纯多糖高剂量组和粗多糖高剂量组可以显著的提高T淋巴细胞的增殖(P<0.01)，表明能提高T淋巴细胞的免疫应答。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 前言

1.1乳酸菌

1.1.1乳酸菌简介

1.1.2乳酸菌的生理特征

1.1.3乳酸菌的主要生理作用

1.1.4植物乳杆菌

1.2多糖

1.2.1多糖简介

1.2.2微生物胞外多糖

1.3乳酸菌胞外多糖

1.3.1乳酸菌胞外多糖的分类

1.3.2乳酸菌胞外多糖的结构

1.3.3乳酸菌胞外多糖的化学组成

1.3.4乳酸菌胞外多糖的生物合成

1.3.5乳酸菌胞外多糖合成中的遗传调控

1.4影响乳酸菌胞外多糖合成的因素

1.4.1菌株遗传特性的影响

1.4.2培养基

1.4.3温度

1.4.4时间

1.4.5 pH值

1.4.6氧分压

1.5乳酸菌胞外多糖的分离纯化

1.6乳酸菌胞外多糖的生理作用

1.6.1抗肿瘤作用

1.6.2免疫调节作用

1.6.3对消化道功能的调节作用

1.6.4对细胞体的保护

1.7乳酸菌胞外多糖在发酵乳方面的应用

1.8本研究目的意义

1.9本研究主要内容

第二章 材料与方法

2.1实验材料

2.1.1试剂与药品

2.1.2培养基

2.1.3仪器与设备

2.1.4菌株

2.1.5动物实验

2.2实验方法

2.2.1乳酸菌的分离

2.2.2高产胞外多糖乳酸菌的筛选

2.2.3 EPS醇沉条件的确定

2.2.4 EPS脱蛋白实验的研究

2.2.5 EPS生物合成条件的研究

2.2.6高产EPS乳酸菌的最适培养条件的确定

2.2.7利用干酪副产物乳清生产EPS的研究

2.2.8胞外多糖的初步分离

2.2.9 EPS毒性及免疫功能的研究

2.3测定方法

2.3.1 EPS的测定

2.3.2 EPS中蛋白值含量的测定

第三章 结果与讨论

3.1高产胞外多糖乳酸菌菌株的筛选

3.2 EPS醇沉淀条件的确定

3.3 EPS脱蛋白实验的研究

3.3.1 Sevag法脱蛋白

3.3.2三氯乙酸法（TCA）脱蛋白

3.3.3酶法脱蛋白

3.3.4酶法脱蛋白最佳条件的优化

3.4 EPS生物合成条件的研究

3.4.1最适生长基本培养基的确定

3.4.2碳源的影响

3.4.3氮源的影响

3.4.4碳氮比的影响

3.4.5盐类的影响

3.4.6培养基初始pH值的影响

3.4.7温度的影响

3.4.8时间的影响

3.4.9接种量对EPS产量的影响

3.5高产EPS乳酸菌的最适培养条件的确定

3.6乳清生产EPS的研究

3.7胞外多糖的初步分离

3.7.1多糖的制备

3.7.2 EPS的紫外全波长扫描

3.7.3 DEAE-52纤维素柱层析分离纯化

3.7.4 Sephadex G-200层析纯化结果

3.7.5 Sephadex G-100层析纯化结果

3.7.6分子量的测定

3.8 EPS毒性及免疫功能的研究

3.8.1急性毒性试验

3.8.2脏器/体重比值测定

3.8.3迟发型变态反应(DTH)(足跖增厚法)

3.8.4小鼠廓清指数实验

3.8.5小鼠血清溶血值测定

3.8.6淋巴细胞增殖功能检测

第四章 结论

参考文献

致谢

在读期间发表的文章