淡水产品中弧菌菌群组成及主要菌群致病性分析

摘要

弧菌是一类重要的食源性致病菌，广泛分布于水产品中，是水生动物的弧菌病的病原体，主要引起人体肠道疾病、伤口感染和败血症等病症。我国食源性疾病监测网的数据显示近年来由弧菌引发的食源性细菌疾病呈上升趋势，并且随着出入境船舶、货物吞吐量的逐年增加，弧菌对人体构成的潜在威胁也在不断增加。因此，了解水产品中弧菌的菌群分布情况，建立快速的检测方法，对确保本地区水域的安全及水产养殖的安全具有重要的意义。具体的研究方法和结果如下:
　　 1、从江苏省部分地区采取55份不同来源的淡水产品，样品经处理后，两次划线于TCBS平板分离纯化出233株分离株，通过生化试验和分子试验的鉴定，结果发现弧菌的种属构成主要是:Vibrioparahaemolyticus、Vibrioalginolyticus、Vibrioharveyi、Vibrioaestuarianus、Vibriometschnikovii、Vibrioazureus、Vibrionatriegens、Vibriodiazotrophicus和Vibrioowensii，其中副溶血弧菌和溶藻弧菌是主要的菌群。从地区分布来看，连云港地区淡水产品中弧菌的检出率明显高于扬州、常州、泰州地区;从样品种类来看，鱼类产品中弧菌的检出率明显高于贝、蟹、虾。
　　 2、对副溶血弧菌和溶藻弧菌这两类主要菌群进行RAPD指纹图谱分析，副溶血弧菌获得了18个不同的基因型，通过UPGMA聚类分析聚成9个（A至I）遗传谱系，其中，谱系A和C是主要的型别。不同型别的副溶血弧菌在地理上和样品中的分析发现，谱系A和C在所有采样地区和样品种类中均有检出，并且连云港地区具有更加丰富的谱带模式，鱼类和虾类的谱带模式较为接近。溶藻弧菌获得了21个不同的基因型，通过UPGMA聚类分析聚成12个（A至L）遗传谱系，其中谱系A、C和K是主要的型别。不同型别的溶藻弧菌在地理上和样品中的分析发现，谱系A和K是4个地区和4类样品中普遍存在的分子型别，并且连云港地区的谱带模式更加丰富，扬州、常州、泰州地区的谱带模式相似，鱼虾蟹中谱带模式丰富。
　　 3、对84株副溶血弧菌种特异性基因（tlh）阳性的分离菌株进行副溶血弧菌的耐热性溶血素基因（tdh）、耐热性溶血素相关毒素基因（trh）的特异性扩增，结果均为阴性。同时所有菌株进行溶血试验，其中12株副溶血弧菌和13株溶藻弧菌出现明显溶血圈，并且他们均是主要型别菌株。挑取主要型别并具有溶血圈的8株弧菌进行小鼠脾细胞黏附试验和小鼠肠积水试验，结果发现8株弧菌对脾细胞均有一定的粘附能力，菌株92粘附能力大于阳性对照菌株;8株弧菌均能引起一定的肠积水，其中71、92、125和214号分离菌株的肠液累积率比较大。说明这些分离菌株具有潜在的致病性。

目录

摘要

缩略语

第一章 综述

1 弧菌概述

2 弧菌检测方法研究进展

2．1 传统的生理生化鉴定

2．2 核酸为基础的检测技术

2．3 免疫学为基础的检测技术

3 弧菌分子分型技术

3．1 RFLP分型技术

3．2 AFLP分型技术

3．3 RAPD分型技术

3．4 SNP技术

4 弧菌的致病性研究

4．1 溶血性毒素

4．2 粘附

4．3 肠毒性

4．4 侵袭力

4．5 摄铁系统

5 论文研究的目的意义和主要内容

第二章 淡水产品中弧菌菌群组分分析

1 材料与方法

1．1 菌株

1．2 主要试剂

1．3 仪器与设备

1．4 主要试剂及培养基的配制

1．5 样品的采集

1．6 样品的检测

2 结果与分析

2．1 分离株的生理生化结果分析

2．2 分离株的分子鉴定结果

2．3 淡水产品中弧菌的检出率

3 讨论

第三章 淡水产品中主要菌群的RAPD分型分析

1 材料与方法

1．1 菌株与试剂

1．2 基因组DNA的制备

1．3 RAPD扩增体系的建立

1．4 RAPD指纹图谱分析

2 结果与分析

2．1 DNA的提取结果

2．2 RAPD扩增重复性实验

2．3 副溶血弧菌指纹图谱分析

2．4 溶藻弧菌的指纹图谱分析

3 讨论

第四章 分离株的致病性分析

1 材料与方法

1．1 菌株

1．2 试剂与培养基

1．3 实验动物

1．4 细菌复苏培养与计数

1．5 兔红细胞的制备

1．6 溶血实验

1．7 弧菌对小鼠脾脏细胞的黏附

1．8 肠致病性的测定

2 结果与分析

2．1 副溶血弧菌致病性相关基因TDH、TRH的PCR扩增

2．2 溶血实验结果

2．3 弧菌对小鼠脾细胞的粘附结果

2．4 小鼠肠积水结果

3 讨论

全文结论

参考文献

附表

致谢

声明