南美白对虾养殖系统中以弧菌为主要菌群的分子生态学研究

摘要

南美白对虾(Litopenaeus vannamei)是当前比较适合规模养殖的对虾种类。随着养殖规模的扩大，对虾病害已成为制约该产业发展的重要障碍，而弧菌是最常见、最重要的细菌性病原菌之一，因此与这些问题息息相关的养殖系统内微生物群落组成也成为迫切需要研究的对象。但目前还没有人系统全面地对南美白对虾不同养殖模式不同养殖时期虾池水体和底泥中以弧菌为主致病菌群落组成进行比较分析。 本研究结合传统微生物培养方法、变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术和16S rDNA克隆文库法初步研究了南美白对虾(Litopenaeus vannamei)粗放养殖A塘、半精养养殖B塘和精养养殖C塘三种不同养殖模式池塘在养殖前期、养殖中期、养殖后期三个不同养殖时期虾池水体和底泥中以弧菌为主的菌群结构，为南美白对虾健康养殖提供理论依据，并为对虾质量安全在养殖源头上的控制打下良好基础。 平板计数结果显示底泥中弧菌数量比水体中的平均高出近1个数量级。除了精养养殖模式C塘底泥中弧菌数量在整个养殖过程中呈现出养殖前期和养殖后期高，养殖中期低的特点外，其他所有样品中的弧菌数量都是随着养殖时期的延长而逐渐增加。对比不同养殖模式，水体中弧菌数量在同一养殖时期同比差别不大，但在底泥中差别明显。 DGGE图谱显示三种不同养殖模式池塘系统中弧菌群落结构彼此显著不同，底泥中弧菌多样性要明显高于水体中的多样性。通过对水体DGGE图谱(图3-3-B)和水体的Shannon-Weaver多样性指数(图3-5-A)的分析发现，不同养殖模式水体中弧菌群落演替规律具有各自的特点，A塘粗放养殖模式演替的基本规律是简单(H'=2.95)-简单(H'=2.95)-复杂(H'=3.27)，B塘半精养模式演替的基本规律是简单(H'=3.29)-复杂(H'=3.31)-简单(H'=3.22)，C塘精养模式演替的基本规律是复杂(H'=3.35)-复杂(H'=3.31)-简单(H'=2.95)。通过对底泥DGGE图谱(图3-4-B)和底泥的Shannon-Weaver多样性指数(图3-5-B)分析发现，不同养殖模式底泥中的弧菌群落演替规律也具有各自特点，A塘粗放养殖模式演替的基本规律是简单(H'=3.12)-复杂(H'=3.35)-复杂(H'=3.19)，B塘半精养模式演替的基本规律是复杂(H'=3.42)-简单(H'=3.27)-复杂(H'=3.39)，C塘精养模式演替的基本规律是复杂(H'=3.22)-复杂(H'=3.27)-简单(H'=2.95)。比较底泥弧菌变化的演替规律与水体弧菌变化的演替规律比较后发现，粗放养殖模式A塘和半精养养殖模式B塘两塘水体、底泥中演替规律不相吻合，而精养养殖模式C塘中的演替规律基本一致。 16S rDNA克隆文库法初步分析了南美白对虾半精养养殖在养殖中期和养殖后期两个不同养殖时期水体和底泥样品中以弧菌为主的菌群结构。结果表明：养殖中期水体和底泥样品中共有弧菌属、泛菌属菌、绿屈挠菌、气单胞菌、耶尔森氏菌属、变形细菌6个属。养殖后期水体和底泥样品中共有弧菌属、泛菌属菌、绿屈挠菌、气单胞菌、哈夫尼菌属、邻单胞菌、变形细菌、甲醇脱氮菌和芽单胞菌属9个属。说明养殖后期以弧菌为主的细菌多样性比养殖中期的有所增加，这也验证了DGGE图谱的结果。，如弧菌属、泛菌属菌、绿屈挠菌等，有些仅在养殖中期出现如耶尔森氏菌属，而哈夫尼菌属(水体)、类志贺邻单胞菌(水体)、甲醇脱氮菌(底泥)和芽单胞菌(底泥)这四种细菌是随着养殖时间的延长在养殖后期时出现的。 同时用16S rDNA克隆文库法分析了南美白对虾半精养养殖(SH克隆文库)和精养养殖(ZH克隆文库)两个不同养殖模式在养殖后期时底泥样品中以弧菌为主的菌群结构。分析结果表明：ZH克隆文库共有弧菌属、邻单胞菌和柠檬酸杆菌；SH克隆文库中共有弧菌属、泛菌属菌、甲醇脱氮菌、气单胞菌、绿屈挠菌和芽单胞菌属。从两种养殖模式相比，养殖后期时精养养殖模式底泥中以弧菌为主的细菌种类比半精养养殖模式底泥中的要少。 最后又对南美白对虾精养养殖模式(B号塘)养殖中期水体和底泥的克隆文库比较可知：水体样品中包括弧菌、耶尔森氏菌、变形细菌、绿屈挠菌和泛菌属菌，其中优势菌顺序为弧菌(33.3％)、绿屈挠菌(18.5％)、泛菌属菌(7.41％)，耶尔森氏菌(3.7％)、变形细菌(3.7％)，同时还存在33.3％的未培养类群；底泥样品中包括弧菌、耶尔森氏菌、气单胞菌、绿屈挠菌和泛菌属菌，其中优势菌顺序为弧菌(50.0％)、泛菌属菌(13.6％)，耶尔森氏菌(4.54％)，同时还存在22.7％的未知培养类群，二者细菌结构有所差别。 在南美白对虾养殖系统的水体和底泥中，首次发现了耶尔森氏菌和绿屈挠菌。在精养养殖模式养殖后期底泥样品(ZH克隆文库)中发现了弗氏柠檬酸杆菌。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 引言

1.1南美白对虾的简介

1.2有关弧菌和弧菌病的概述

1.3有关弧菌病的致病机理

1.4有关南美白对虾弧菌病的研究概况

1.5传统方法在微生物多样性研究中的应用

1.6分子标志物在微生物多样性研究中的应用

1.7分子生物学在微生物多样性研究中的应用

1.7.1群落水平总DNA的分析方法

1.7.2基于分子杂交技术的分子标记

1.7.3基于PCR的分子标记技术

1.8利用DGGE技术研究微生物多样性的国内外进展

1.8.1利用DGGE技术研究微生物多样性的国外进展

1.8.2利用DGGE技术研究微生物多样性的国内进展

1.9南美白对虾养殖系统中微生物研究的进展

1.10本研究的内容和技术路线

1.10.1研究内容

1.10.2研究路线

第二章材料与方法

2.1材料

2.1.1样品采集

2.1.2试验仪器和设备

2.1.3试剂

2.2方法

2.2.1养殖水体和底泥的弧菌数量测定

2.2.2环境样品微生物总基因组DNA的提取

2.2.3细菌16S rDNA片断的PCR扩增

2.2.4弧菌16S rDNA(带“GC”夹子)片断的PCR扩增

2.2.5弧菌16S rDNA(不带“GC”夹子)序列片断的扩增

2.2.6 DGGE分析

2.2.7 DGGE条带的回收、纯化

2.2.8弧菌特异引物片断的连接

2.2.9转化与克隆

2.2.10测序及序列分析

2.2.11文库库容的评价

第三章结果与讨论

3.1南美白对虾养殖系统中弧菌为主要菌群的PCR-DGGE分析

3.1.1水体和底泥样品主要环境因子分析和弧菌数量变化

3.1.2水体和底泥样品中弧菌群落结构DGGE分析

3.1.3 DGGE优势条带的序列分析

3.2半精养模式(B塘)养殖中期和后期水体、底泥的弧菌为主要菌群的克隆文库比较

3.2.1养殖系统中水体和底泥样品的理化和微生物性状比较

3.2.2 DNA的提取和PCR扩增

3.2.3样品的16S rDNA克隆文库分析

3.2.4样品中弧菌菌群系统发育分析

3.3养殖后期底泥样品中半精养养殖模式(B塘)和精养养殖模式(C塘)弧菌为主要菌群的克隆文库比较

3.3.1养殖系统中水体和底泥样品的理化和微生物性状比较

3.3.2 DNA的提取和PCR扩增

3.3.3样品的16S rDNA克隆文库分析

3.3.4样品中弧菌菌群系统发育分析

3.4半精养养殖池塘(B塘)养殖中期水体和底泥弧菌为主要菌群的克隆文库比较

3.4.1养殖系统中水体和底泥样品的理化和微生物性状比较

3.4.2 DNA的提取和PCR扩增

3.4.3样品的16S rDNA克隆文库分析

3.4.4样品中弧菌菌群系统发育分析

3.5全文讨论

3.5.1有关不同养殖模式的讨论

3.5.2有关不同生长时期的讨论

3.5.3有关养殖水体和底泥的讨论

3.5.4养殖虾池水温和pH值与细菌的关系

3.5.5有关池塘选择

3.5.6有关放苗时间和放苗密度的选择

3.5.7有关弧菌特异引物的讨论

3.5.8有关样品中部分菌群稳定存在的讨论

3.5.9有关样品中条件致病菌和不常见菌的讨论

全文总结

本论文创新点

不足与展望

参考文献

附录

致谢

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