ENU诱变获得一种多趾小鼠及其突变基因的鉴定

摘要

乙酰基亚硝基脲(Ethylnitrosourea，ENU)是一种人工合成能够导致多种生物体产生随机单碱基突变的高效烷化剂，利用ENU诱变可在较短时间内获得大量突变小鼠。本实验室采用ENU诱变手段，筛选获得了一种常染色体显性遗传的多趾突变小鼠，该突变小鼠呈现出轴前多趾现象，严重程度不一。本研究以这种突变系小鼠为对象，对突变基因进行了染色体定位，在初步确定了Alx4为该突变候选基因基础上，对Alx4基因进行了序列分析，确定Alx4基因突变是引起多趾表型的主要原因。我们的工作分以下2个部分:
　　 1、多趾小鼠的获得及突变基因的定位
　　 ENU人工诱变后，在G1代小鼠中筛查发现了一例多趾突变表型的小鼠。将其与野生型C57BL/6J(B6)B6小鼠配种后记录的71只后代小鼠中，有15只后代出现多趾表型。将后代正常表型小鼠进一步与B6野生型交配，部分小鼠后代存在多趾表型，以上结果说明该突变表型属于一种呈不完全外显率的显性遗传。B6多趾小鼠与野生型DBA/2J(D2)配种获得的19只后代小鼠中，有4只多趾突变。(B6×D2)F1代多趾突变小鼠回交B6得到的317只[(B6×D2)F1×B6]N2代小鼠中，有61只多趾突变。N2代突变小鼠互交得到的25只后代中有12只杂合子，6只纯合子，7只正常。
　　 突变杂合子小鼠在后趾内侧（即轴前部）比正常小鼠多出一个脚趾，且严重程度不一;纯合子则更为严重，不仅前后肢都有多趾（多达7趾），而且后肢畸形，另外发现新生纯合子小鼠存在眼睑开裂现象。阿尔新蓝—茜素红染色结果显示突变杂合子小鼠与野生型相比，在后趾轴前部明显多出一趾，纯合子四肢多趾，后肢胫骨畸形，生长不全。多出的趾有的是与正常趾并行长出，有的则在原来的脚趾上长出一个分支，其他骨骼-软骨与正常相比未见明显异常。
　　 为了定位该突变基因，提取[(B6×D2)F1×B6]N2代小鼠的鼠尾DNA，利用44个微卫星对突变小鼠的常染色体和X染色体进行基因组扫描。第一轮筛选发现突变基因与2号染色体上的微卫星D2mit58在28个中交换了5例，LOD值为2.71，有可能连锁，而其余微卫星均无连锁倾向。在初步扫描基础上，在D2Mit58附近继续采用高密度微卫星标记并扩大N2代突变小鼠样品的数目，进一步定位结果表明在60个样品中突变基因分别与微卫星D2mit184(53.07cM)交换5例，LOD值为10.59;与D2mit45(50.63cM)交换4例，LOD值为11.68，确定连锁，并将突变基因定位于微卫星D2Mit184与D2Mit45之间，通过对局部区域基因功能分析初步判定Alx4基因为本突变候选基因。
　　 2、Alx4基因的序列分析
　　 针对Alx4基因的4个外显子在其两侧设计了4对引物，对Alx4基因组DNA进行PCR扩增，产物回收后经过测序比对，最终发现多趾杂合子小鼠测序图上单位点存在明显的A-T重叠信号，RT-PCR测序结果与基因组DNA测序结果一致。该突变位于Alx4基因编码区第433位碱基处（位于Alx4基因第2号外显子），突变导致编码区第145位密码子AAA（编码赖氨酸）变为终止密码子TAA，引起蛋白编码提前终止，判定这是出现多趾表型的主要原因。

目录

符号说明

第一部分 文献综述

第一章 ENU诱变及突变基因的定位和克隆

第二章 四肢的发育及多指(趾)的相关研究

参考文献(References)

第二部分 实验内容

第三章 ENU诱变获得一种多趾小鼠及其突变基因的染色体定位

1 材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

5 参考文献

第四章 Alx4基因的序列分析

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

5 参考文献

致谢

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