β-呋喃果糖苷酶单克隆抗体的研制及其在蜂蜜掺假ELISA中的应用

摘要

蜂蜜是蜜蜂从开花植物的花中采得的花蜜在体内经过转化并吐回蜂巢中酿制成的。蜂蜜的成分除了葡萄糖、果糖外，还含有丰富的各种维生素、矿物质和氨基酸。其味道甜蜜，所含的单糖不需要经消化就可以被人体吸收，对妇、幼特别是老人更具有良好的保健作用，因而是一种营养丰富的天然滋养食品。蜂蜜的需求量很大，受利益驱使，近年来国内蜂蜜掺假造假现象十分严重，危害消费者身体健康，并严重阻碍中国蜂业的健康发展。
　　 检测掺假蜂蜜的方法有很多，例如3C/12C同位素比率分析法、高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法、双果糖酐(DFAs)检测法、高效液相色谱法、近红外光谱法、旋光法、高效毛细管电泳等，但这些方法都或多或少的存在着设备要求高、操作复杂、鉴定类型单一等缺点。而免疫学方法，特别是酶联免疫吸附法(ELISA)，由于其具有灵敏度高、特异性强、检测速度快、操作简单等优点，为蜂蜜掺假的检测提供了新的思路。
　　 β-呋喃果糖苷酶（β-fructofurnosidase）是食品工业中用来水解蔗糖的D-果糖β糖苷的果糖苷键的酶，在高浓度的蔗糖溶液中，β-呋喃果糖苷酶可催化转糖基作用，在蔗糖的果糖基上通过β-(2，1)糖苷键连接1～3个果糖而形成果糖寡聚体。在低浓度蔗糖溶液中，β-呋喃果糖苷酶则主要是催化蔗糖水解，生成果糖和葡萄糖。如果将蔗糖水解后的果糖和葡萄糖掺入蜂蜜中，用一般的方法会难以鉴别，而通过检测蜂蜜中掺入转化糖而残留的β-呋喃果糖苷酶有助于确定是否存在掺糖造假。
　　 本研究旨在建立一种快速、灵敏、简便且经济的β-呋喃果糖苷酶酶联免疫检测方法并将其应用于植物转化糖类的蜂蜜掺假检测为目的。采用杂交瘤技术制备抗β-呋喃果糖苷酶单克隆抗体并建立双抗夹心ELISA法检测蜂蜜中β-呋喃果糖苷酶残留的方法。通过对比不同来源的蔗糖转化酶，分别采用考马斯亮蓝法和BCA法，SDS-PAGE测定其蛋白质浓度和纯度，结果表明每10mg蔗糖酶溶于1mL超纯水中所得溶液蛋白浓度为5.6mg/mL，且纯度很高。用其作为免疫原免疫小鼠后，采用杂交瘤技术获得9株杂交瘤细胞株，分别命名为1D6F2、8F8C5、8F8A9、1D6D12、8F8G3、8F8A6、8F8F10、1D6B10、1D6B11。用前四株制备4种腹水，制备的腹水效价基本在1:16，000以上，腹水以及包被抗原的工作浓度分别为1:16000和1:8000。通过相加实验测定8F8C5和8F8A9两株是针对不同抗原表位，并以此为基础建立双抗夹心ELISA的检测方法，检验建立后的双抗夹心ELISA法特异性良好，敏感性高，无明显的交叉反应。在对于蜂蜜掺假的检测中，对样品做8倍稀释后，在5～80ng/mL范围内，标准线性方程为:y=-0.2359x+0.6421，R2=0.9878。

目录

符号说明

第一章 绪论

1 蜂蜜的组成及功效

2 掺入植物糖类造假蜂蜜的鉴别方法

2．1 一些简单的辨别方法

2．2 碳同位素比率分析法

2．3 高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法

2．4 双果糖酐检测法

2．5 高效液相色谱法

2．6 近红外光谱法

2．7 显微镜检测法

2．8 旋光法

2．9 高效毛细管电泳

3 蜂蜜的食品安全国家标准

4 蔗糖酶概述

4．1 蔗糖酶的来源

4．2 酶学性质

4．3 β-呋喃果糖苷酶的作用方式及其机理

4．4 β-呋喃果糖苷酶在生产中的应用

4．5 酶活力的测定

5 本研究的目的及意义

第二章 β-呋喃果糖苷酶纯度及蛋白浓度的测定

1 材料与方法

1．1主要试剂

1．2 仪器与设备

1．3 主要溶液系统

1．4 β-呋喃果糖苷酶纯度的测定

1．5 β-呋喃果糖苷酶蛋白浓度测定

2 结果与分析

2．1 SDS-PAGE结果

2．2 酶蛋白质浓度

3 讨论

第三章 β-呋喃果糖苷酶抗体的研制及鉴定

1 材料与方法

1．1 主要试剂

1．2 仪器与耗材

1．3 实验动物和生物材料

1．4 主要溶液系统

1．5 单克隆抗体的制备

1．6 单克隆抗体性质的鉴定

1．7 ELISA检测方法的建立

2 结果及分析

2．1 包被抗原工作浓度、封闭液以及阳性血清效价的确定。

2．2 单克隆抗体细胞株的建立及其稳定性

2．3 腹水的制备

2．4 单克隆抗体的鉴定

3 讨论

3．1 单抗的制备

3．2 抗体的鉴定

第四章 双夹心ELISA方法的建立和应用

1 材料和方法

1．1 实验样品

1．2 试剂和仪器

1．3 双抗夹心法的建立

1．4 包被抗体的选择

1．5 双抗夹心ELISA反应条件的选择

1．6 双抗夹心ELISA特异性鉴定

1．7 样品基质干扰检测

1．8 敏感性试验

1．9 样品添加回收试验

2 结果及分析

2．1 包被抗体的选择

2．2 双抗夹心ELISA反应条件的选择

2．3 双抗夹心ELISA特异性的鉴定

2．4 样品机制干扰检测结果

2．5 敏感性试验结果

2．6 标准曲线的确定

2．7 添加回收率及重复性

3 讨论

结论

参考文献

致谢

声明