鸡黑素皮质素受体4基因的分子克隆及其突变体的药理学特性初步研究

摘要

黑素皮质素受体4(melanocortin-4 receptor，MC4R)是一个调节能量动态平衡的重要信号分子，具有介导瘦蛋白(Leptin)的功能，在动物的摄食和能量平衡调控中起着关键作用，其主要作用是控制食欲、体重、能量代谢，已知MC4R基因的突变与猪、鼠和人等的食欲、肥胖、生长等性状有关，而鸡MC4R基因的功能却知之甚少。
　　为揭示MC4R在鸡的生长及能量调控中所起的作用，本研究通过对鸡MC4R基因进行分子克隆及真核表达载体的构建，获得cMC4R-myc-pcDNA3.1(+)重组质粒后，对鸡的MC4R基因进行定点突变，然后将带有野生型和突变型cMC4Rs基因的质粒以磷酸钙沉淀法转染HEK293T细胞，用流式细胞仪测定野生型和突变型cMC4Rs的总受体蛋白和细胞表面受体蛋白的表达水平，同时进行竞争性配体结合试验，研究野生型和突变型cMC4Rs与不同配体的结合能力。主要研究结果如下:
　　1、根据NCBI公布的鸡MC4R基因编码序列设计1对特异性引物，由鸡的基因组DNA扩增鸡MC4R基因编码区，克隆得到的鸡MC4R基因编码区为996bp，编码332个氨基酸。将鸡MC4R基因片段以T4DNA连接酶连接于真核表达载体pcDNA3.1(+)获得重组质粒cMC4R-myc-pcDNA3.1(+)。
　　2、设计包含突变位点的正、反向引物，选择Stratagene公司的QuikChange Site-directedMutagenesis试剂盒以重组质粒cMC4R-myc-pcDNA3.1(+)为模板进行单点突变获得4个突变型cMC4Rs，分别为G21R、S76L、L299P和Q18H。
　　3、将带有野生型和突变型cMC4Rs基因的质粒以磷酸钙沉淀法转染HEK293T细胞，用抗myc单克隆抗体和Alexa Fluor488标记的羊抗小鼠IgG对稳定表达的细胞进行免疫荧光染色，流式细胞仪测定表达水平，结果显示，在总表达水平上，4个突变体中只有cMC4RG21R显著降低(P＜0.05)，但其细胞表面表达水平与cMC4R WT差异不显著;其他3个突变体cMC4R S76L、eMC4R L299P和cMC4R Q18H的细胞表面表达量和总表达量与cMC4R WT差异均不显著，表明这3个突变体与cMC4R WT相比表达水平正常。
　　4、用稳定表达野生型和突变型cMC4Rs的细胞进行竞争性配体结合试验，分别用内源性配体α-MSH和β-MSH以及α-MSH的高效类似物NDP-MSH竞争125I-NDP-MSH与受体结合，结果显示，在配体结合能力上，除cMC4R L299P以外，cMC4R WT和突变体G21R、S76L和Q18H都具有一定的功能，且发生以上3个突变后，与配体的结合能力均有所下降，突变体cMC4R L299P几乎失去了与配体结合的能力;cMC4R WT以及突变受体与三种配体的亲和力大小分别为NDP-MSH＞α-MSH＞β-MSH。