结核分枝杆菌TB10.4蛋白调节RAW264.7细胞自噬、炎性因子分泌及其真核表达质粒构建和免疫原性的初步研究

摘要

结核分枝杆菌作为最古老的病原菌之一仍然威胁着人类的健康，且目前尚没有完全可靠的结核病疫苗面世。在这种情况下，了解结核分枝杆菌的致病机理、研究其逃逸宿主免疫防御的机制，对进一步提高BCG疫苗的保护效力或研发新型的疫苗具有指导意义。结核分枝杆菌侵入机体后，能够成功的生存于宿主的免疫细胞如巨噬细胞、树突状细胞中。目前，已有报道的分枝杆菌的逃逸宿主免疫防御的方式主要包括三种:1）抑制吞噬体的成熟过程，阻碍其与溶酶体的融合;2）抵抗RNI和ROI;3）抑制MHC抗原分子的加工和提呈，阻碍T细胞的识别。细胞自噬不仅作为一种维持细胞内环境稳态的机制，同时也是天然免疫防御机制的重要组成部分。此外，细胞自噬也被发现与抗原提呈、细胞因子的调控密切相关。结核分枝杆菌能够抑制自噬体的成熟过程，从而避免自噬对其的杀伤。研究发现，通过促进细胞自噬能够有效的杀灭细胞内的分枝杆菌。包括细胞因子、Vitamin-D、离子环境、ROS都在自噬的发生过程中发挥了重要的作用。
　　TB10.4蛋白能够激发强烈的细胞免疫，是疫苗研发的重要候选抗原之一，但是TB10.4蛋白在细菌感染与免疫中发挥的功能未见系统报道。因此，本研究采用原核表达制备的TB10.4蛋白为材料，初步研究了其在RAW264.7巨噬细胞自噬发生过程中以及对细胞因子分泌所产生的影响;此外，构建了TB10.4的真核表达质粒并鉴定了其免疫原性，为进一步研究TB10.4蛋白功能奠定了基础。
　　一TB10.4蛋白调节脂多糖诱导的RAW264.7细胞自噬和炎性因子分泌的初步研究
　　以原核表达蛋白TB10.4作用于脂多糖自噬促进下的RAW264.7细胞，通过观察自噬相关蛋白LC3BⅡ和Beclin-1，发现仅需10μg/mL TB10.4就能够明显抑制LPS诱发的自噬现象，并且这一抑制现象在作用30分钟后就能观察到，表现为LC3BⅡ和Beclin-1表达量的降低;此外，以Bafilomycin A1抑制自噬降解途径后发现LC3BⅡ的表达含量下降，说明自噬体的合成受到了抑制。进一步检测细胞上清中的细胞因子和NO的表达含量，发现TB10.4能够降低TNF-α、NO的表达、增加IL-1β的表达，对IL-6无明显作用。此外，TB10.4能够持续激活RAW264.7中ERK、p70S6K的磷酸化，而AKT的磷酸化则表现为先升高然后回复正常。而在BCG的感染RAW264.7试验中，以IFN-γ/LPS/Rapamycin分别激活细胞自噬，发现TB10.4能够明显保护BCG在Rapamycin作用下RAW264.7中的增殖活力。这些结果提示TB10.4可能在炎性条件下的细菌感染中发挥重要作用。
　　二TB10.4蛋白真核表达质粒的构建及其免疫原性的初步鉴定
　　以pVAX1为载体分别构建了TB10.4和GFP-TB10.4的表达质粒，通过RT-PCR和间接免疫荧光试验，证实这两种质粒在细胞中得到了成功的表达。此外，以pVAX1-TB10.4作为免疫原免疫小鼠，分别设立了pVAX1-TB10.4组、BCG组、BCG/联合免疫组和PBS对照组，测定了免疫小鼠血清中特异性抗体效价和脾细胞中IFN-γ和IL-4的分泌能力。结果显示，免疫小鼠产生了特异性抗体，但是抗体效价较低，且各对照组之间没有明显的差异。而IFN-γ的测定中，在Bovine-PPD的刺激下，BCG/pVAX1-TB10.4联合免疫组IFN-γ表达水平显著高于其余各组，而在重组蛋白刺激下，IFN-γ含量无明显差异。而在IL-4的测定中，各组值均较低。因此，成功获得了TB10.4的真核表达质粒，这种质粒能够有效激发小鼠的特异性免疫应答，为进一步研究TB10.4的功能奠定了基础。