卡尼鄂拉蜂锌转运蛋白--7相似蛋白基因的克隆及差异表达分析

摘要

本研究以卡尼鄂拉蜂Apis mellifera carnica为研究对象，采用基因克隆、原核表达、Real-time PCR等方法分析卡尼鄂拉蜂ZnT-7-like基因在原核表达系统中的表达情况，制备兔抗卡蜂ZnT-7-like多克隆抗体，并对该基因在卡蜂3、6、9、12、16日龄mRNA和蛋白表达差异进行分析，以期发现该基因在不同日龄卡尼鄂拉蜂咽下腺的差异表达规律，为其功能研究提供理论依据。同时构建含有EGFP报告基因的融合表达载体pEGFP-ZnT-7-like，实现该基因亚细胞水平的表达定位，并通过免疫组化技术研究该基因组织分布情况。 主要研究结果如下: 1.参考GenBank中意大利蜜蜂ZnT-7-like基因的mRNA序列设计引物，以咽下腺总RNA为模板进行反转录，以所获得的cDNA为模板扩增该基因全长序列，通过生物信息学手段对该基因核酸和蛋白序列进行分析。结果表明，克隆得到卡尼鄂拉蜂ZnT-7-like基因CDS序列与GenBank中的序列完全一致，表明在同一个蜜蜂种下不同的亚种之间该基因相当保守;ZnT-7-like蛋白二级结构预测表明该蛋白为α型蛋白;跨膜结构预测分析表明该蛋白有六个跨膜区域;对ZnT-7-like蛋白进行二硫键的预测，发现该蛋白可能含有两个二硫键，成键位点可能在50、75、308和315;进行聚类分析，表明该蛋白与同为膜翅目的小蜜蜂、欧洲熊蜂以及切叶蜂亲缘关系最近，与鳞翅目家蚕、哺乳动物人、小鼠、禽类原鸡以及斑马鱼及植物二穗短柄草亲缘性逐级递减。 2.选择部分序列(273 bp)为多肽免疫序列，将其亚克隆入原核表达载体pGEX-4T-1，然后转化入表达菌株BL21(DE3)，经IPTG诱导表达获得大小约为35 kDa融合蛋白;纯化后免疫新西兰大白兔，制备其多克隆抗体，并用间接ELISA和蛋白免疫印迹技术检测抗体的效价及特异性，制备的多克隆抗体效价为1∶64，000，具有很高的特异性。 3.对ZnT-7-like基因在卡尼鄂拉蜂3，6，9，12和16日龄咽下腺表达水平进行实时荧光定量PCR检测，结果表明，该基因在卡尼鄂拉蜂5个日龄工蜂中的转录情况存在较大差异，其中3日龄表达量极显著高于其他日龄(P＜0.01)，12日龄表达量最低，其他日龄间表达量两两差异显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01);对ZnT-7-like蛋白在卡尼鄂拉蜂3，6，9，12和16日龄咽下腺进行Western blot定量分析，结果表明，ZnT-7-like蛋白在卡尼鄂拉蜂5个日龄工蜂咽下腺中的蛋白表达与转录水平基本一致。 4.本研究构建了真核表达载体pEGFP-ZnT-7-like，通过脂质体(LTX)介导基因转染DF-1细胞，观察基因表达产物的分布，并检测mRNA和融合蛋白在体外水平的表达。结果表明ZnT-7-like蛋白不含信号肽序列，融合蛋白在细胞质中表达，转染pEGFP-C1后荧光蛋白均匀分布于整个细胞。 5.通过制备卡蜂咽下腺石蜡切片以及免疫组化分析，检测卡尼鄂拉蜂3、6、9、12、16日龄ZnT-7-like蛋白阳性面积率，结果表明切片中细胞核被染上蓝色，咽下腺ZnT-7-like蛋白呈现棕黄色，背景清晰。卡尼鄂拉蜂5个日龄咽下腺组织切片均呈ZnT-7-like蛋白免疫阳性，3日龄中的表达量极显著高于其他日龄(P＜0.01)，12日龄表达量最低，其他日龄间表达量两两差异极显著(P＜0.01)。这与转录和Western blot水平差异性规律是一致的。

目录

摘要

符号说明

第一章 前言综述

1 锌的生物学功能

1．1 锌的概述

1．2 锌与疾病

1．3 蜂王浆中的锌及其来源

2 锌转运蛋白的概述

2．1 锌转运体家族

2．2 锌转运蛋白的结构性质

2．3 ZnT7蛋白的研究进展

3 基因原核表达研究

3．1 真核基因的克隆

3．2 实时荧光定量PCR

3．3 蛋白质印迹

3．4 免疫组化

3．5 生物信息学分析

4 研究目的和意义

5 技术路线

第二章 卡尼鄂拉蜂ZnT-7-like基因的克隆及生物信息学分析

1 材料与试剂

1．1 供试材料

1．2 试剂与仪器

2 试验方法

2．1 ZnT-7-like基因的克隆及pMD19-T-ZnT-7-like基因载体构建

2．2 ZnT-7-like基因目的片段的克隆测序

2．3 ZnT-7-like基因生物信息学分析

3 结果与分析

3．1 ZnT-7-like基因的克隆及pMD19-T-ZnT-7-like载体构建

3．2 ZnT-7-like基因的生物信息学分析

4 讨论

5 结论

第三章 ZnT-7-like基因原核表达载体构建及多克隆抗体制备

1 材料与试剂

1．1 供试材料

1．2 菌株与载体

1．3 试剂与仪器

2 试验方法

2．1 表达性重组质粒pGEX-4T-1-ZnT-7-like的构建

2．2 pGEX-4T-1-ZnT-7-like融合蛋白的诱导表达

2．3 抗原制备及动物免疫

2．4 血清的分离

2．5 抗体的ELISA检测

2．6 Western blot检测

3 结果与分析

3．1 pGEX-4T-1-ZnT-7-like重组表达载体的构建

3．2 GST-ZnT-7-like融合蛋白的诱导表达及纯化

3．3 兔抗卡蜂ZnT-7-like多克隆抗体的效价和特异性检测

4 讨论

5 结论

第四章 卡尼鄂拉蜂ZnT-7-like基因的真核表达及亚细胞定位

1 材料与试剂

1．1 实验材料

1．2 主要试剂

1．3 其它主要试剂的配制

1．4 主要的仪器设备

2 实验方法

2．1 重组质粒pEGFP-ZnT-7-like的构建及鉴定

2．2 细胞培养及传代

2．3 重组质粒pEGFP-ZnT-7-like转染DF-1细胞

2．4 ZnT-7-like基因在DF-1细胞中的mRNA表达检测

2．5 ZnT-7-like基因在DF-1细胞中的蛋白表达检测

3 结果与分析

3．1 真核表达载体pEGFP-ZnT-7-like的构建和鉴定

3．2 重组质粒pEGFP-ZnT-7-like转染DF-1细胞的检测结果

3．3 RT-PCR检测ZnT-7-like基因的表达

3．4 WB检测细胞中蛋白的表达

4 讨论

5 结论

第五章 卡尼鄂拉蜂不同日龄工蜂咽下腺ZnT-7-like基因的差异表达

1 试验材料

1．1 供试材料

1．2 主要试剂

1．3 主要仪器

2 试验方法

2．1 ZnT-7-like基因在不同日龄卡蜂咽下腺中的表达水平检测

2．2 ZnT-7-like蛋白的蛋白免疫印迹分析

2．3 卡蜂王浆腺石蜡切片制作及ZnT-7-like蛋白的免疫组化分析

3 结果与分析

3．1 RNA提取结果

3．2 实时荧光定量PCR的熔解曲线

3．3 标准曲线的绘制

3．4 卡蜂ZnT-7-like基因表达规律

4 讨论

5 结论

参考文献

全文结论

致谢

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