卡尼鄂拉蜂(Apis mellifera carnica)工蜂咽下腺泌浆调控机制的研究

摘要

咽下腺是工蜂合成和分泌蜂王浆的主要器官，其发育程度和泌浆活性直接影响到工蜂分泌蜂王浆的产量和质量。适龄工蜂泌浆行为一直是国内外研究的热点问题，但咽下腺发育及合成、分泌王浆的调节机制尚不清晰。 本研究基于适龄工蜂泌浆行为的充分认识，合理地设计实验思路，以卡尼鄂拉蜜蜂（卡蜂）为实验对象，解剖五组不同日龄内勤蜂(3、6、9、12、16日龄)及三组不同阶段越冬蜂（越冬阶段、舂繁阶段和淘汰阶段）咽下腺，采用解剖形态学、Illumina Solexa转录组学和iTRAQ定量蛋白质组学相关联的技术，充分挖掘蜜蜂咽下腺发育及应答阶段的形态学、基因表达及蛋白表达的差异，筛选泌浆行为相关的分子标记物，以期阐明咽下腺活性的分子调节机制，为分子标记辅助育种提供理论依据。主要研究内容和结果如下: 1、通过对咽下腺小囊外部形态和细胞内部结构电镜分析表明，卡蜂咽下腺小囊总体发育较为迟缓;咽下腺王浆合成和分泌活性取决于小囊发育程度，有多种细胞器的参与;不同日龄内勤蜂中，9日龄工蜂咽下腺小囊直径最大，细胞器水平最高;在越冬蜂中，春繁阶段工蜂咽下腺小囊直径最大，细胞器水平最高;其小囊直径和细胞器水平均低于9日龄工蜂，为解释越冬蜂的哺育幼虫能力较低提供细胞学证据。花粉在提供营养保障的同时，其成分可能会调节咽下腺活性。 2、转录组学测序构建8个测序文库，共获得4千多万条reads，比对得到2.5万个基因，五组内勤蜂和三组越冬蜂分别获得3658、698个差异表达基因，其中共有的差异表达基因分别为108个和50个。GO富集分析表明，内勤蜂差异表达基因GO聚类主要集中在结构分子活性、质膜、信号传导、细胞骨架、肌动蛋白和系统发育;而越冬蜂的差异表达基因GO聚类主要集中在α-葡糖苷酶活性、水解酶活性、防御反应等;1000多个DEGs富集于100条pathways，集中在能量代谢、酶活性、氨基酸代谢、蛋白合成和转运等相关通路中。MRJP2、线粒体核糖体RNA、葡萄糖氧化酶、MRJP1、MRJP4、MRJP5、微管蛋白和α-葡糖苷酶等基因在内勤蜂和越冬蜜蜂中均有较高的转录水平，并且与咽下腺发育规律和活性调控基本一致。营养（特别是花粉）和幼虫的刺激通过核糖体通路和PI3K-Akt介导的TOR通路，调节咽下腺细胞代谢、酶活性等，完成对咽下腺活性的调节，进而影响工蜂的社会分工。 3、蛋白质组学共计获得60万个二级图谱总数，在内勤蜂和越冬工蜂分别鉴定到1282、2156个蛋白，其中284、698个为差异表达蛋白。在不同发育阶段的内勤蜂，其蛋白表达规律有所不同:与3日龄相比，在6日龄中发现了112个DEPs，其中31个(27.2％)上调表达，81个(72.3％)下调表达;在9日龄中发现117个DEPs，其中36个(30.8％)上调表达，81个(69.2％)下调表达;在12日龄中发现127个DEPs，其中42个(33.1％)上调表达，85个(66.9％)下调表达;在16日龄中发现127个DEPs，其中39个(30.7％)上调表达，88个(69.3％)下调表达。越冬蜂的蛋白表达规律亦随着其泌浆行为的变化而改变:与春繁蜂相比，越冬蜂有255个DEPs，其中150个(58.82％)上调表达，105个(41.18％)下调表达;与淘汰蜂相比，越冬蜂有374个DEPs，其中161个(43.05％)上调表达，213个(56.95％)下调表达;与淘汰蜂相比，春繁蜂有417个DEPs，其中193个(46.28％)上调表达，224个(53.72％)下调表达。Pathway富集分析表明，内勤蜂DEPs主要要富集在RNA转运通路(RNA transport)、核糖体通路（Ribosome）、蛋白合成和NOD样受体信号通路(NOD-like receptor signaling pathway)等调控基因转录的通路中;春繁期间，上述通路出现了与9日龄相似的富集规律，同时伴随着王浆合成和分泌，能量消耗极大，糖类代谢、线粒体中的TCA循环和果糖、甘露糖代谢，为春繁蜂泌浆行为提供了能量保障和原料供应。 4、转录组学和蛋白质组学关联分析表明，内勤蜂各日龄中，mRNA与相应的蛋白质表达丰度相关性，表明在16日龄与3日龄工蜂比较组合中，DEGs和DEPs相关性最高(r=0.3828)，其次为12日龄与3日龄工蜂比较组合(r=0.3236)，属中度相关性;而9日龄与3日龄工蜂比较组合(r=0.1725)和6日龄与3日龄工蜂比较组合(r=0.0360)，相关性较低，属低度相关性。越冬前后工蜂鉴定到2156个蛋白，转录组和蛋白质组表达丰度的相关性分别为0.1729，0.1373和0.0226，均为低度相关。王浆主蛋白成分的转录水平和蛋白水平具有较高的一致性。核糖体通路和RNA转运通路是关联性最高的两个通路，以此解释咽下腺发育机制和泌浆应答机制。

目录

论文说明

摘要

缩略词表

第一章 文献综述

1 西方蜜蜂生物学概述

1．1 西方蜜蜂种属简介

1．2 西方蜜蜂社会性

2 工蜂咽下腺形态学及发育生物学研究研究进展

2．1 咽下腺解剖形态学

2．2 咽下腺活性研究进展

3 转录组学研究方法及其在蜜蜂分子生物学中的研究进展

3．1 转录组学研究方法

3．2 转录组学在蜜蜂分子生物学中的研究进展

4 蛋白质组学研究方法及其在蜜蜂分子生物学中的研究进展

4．1 蛋白质组学研究方法

4．2 蛋白质组学在蜜蜂分子生物学中的研究进展

5 转录组和蛋白质组比较关联分析研究进展

6 本研究的目的意义

第二章 卡尼鄂拉蜂工蜂咽下腺解剖形态学研究

1 材料和方法

1．1 实验材料

1．2 主要试剂和仪器

1．3 研究方法

2 结果与分析

2．1 不同日龄工蜂咽下腺形态学扫描电镜观察

2．2 不同日龄工蜂咽下腺形态学透射电镜观察

3 讨论

第三章 卡尼鄂拉蜂工蜂咽下腺转录组测序分析

1 材料和方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 RNA提取及质量检测

2．2 测序质量控制及原始数据统计分析

2．3 基因表达水平及DEGs筛选

2．4 DEGs基因功能注释及功能预测

2．5 荧光定量PCR验证

3 讨论

3．1 西方蜜蜂工蜂转录组测序数据库

3．2 咽下腺活性相关的DEGs

3．3 调控通路富集分析

第四章 卡尼鄂拉蜂工蜂咽下腺蛋白质组学分析

1 材料和方法

1．1 实验材料

1．2 主要试剂

1．3 主要仪器设备

1．4 主要数据库及软件

1．5 蛋白提取及检测

1．6 iTRAQ实验过程

1．7 数据分析流程

1．8 荧光定量PCR验证

2 结果与分析

2．1 蛋白质检测

2．2 蛋白质鉴定及质量评估

2．3 蛋白质功能注释

2．4 差异表达蛋白质分析

2．5 荧光定量PCR验证

3 讨论

3．1 内勤蜂咽下腺差异表达蛋白

3．2 不同阶段越冬工蜂咽下腺差异表达蛋白

第五章 转录组学与蛋白质组学比较关联分析

1 材料和方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

2 结果和分析

2．1 内勤蜂转录组和蛋白质组比较关联分析

2．2 越冬蜂转录组和蛋白质组比较关联分析

3 讨论

3．1 转录组和蛋白质组鉴定结果比较关联分析

3．2 转录组和蛋白质组表达丰度比较关联分析

3．3 转录组和蛋白质组调控通路的比较关联分析

全文结论

全文创新点

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表学术论文(第一作者)

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