草茹多糖的分离纯化、生物活性研究及结构分析

摘要

草菇（Volvariella volvacea），又名稻草菇、兰花菇、中国蘑菇等，属担子菌纲、伞菌目、毒伞科、苞脚菇属，是世界上第三大栽培食用菌。糖类物质是草菇主要的营养成分，草菇多糖更是具有重要生理功能的活性物质。本文主要对草菇多糖的提纯工艺及生物活性进行了研究，初步分析了多糖结构并推测构效关系，研究结果如下:
　　1.对草菇多糖提取工艺进行了研究，主要探讨了热水提取法、微波辅助热水热水提取法和木瓜蛋白酶法工艺的优化。通过单因素和响应面优化实验，确定了热水提取草菇多糖的最优工艺条件:料液比1∶65(g/mL)，79℃提取4.4h，反复提取1次，多糖得率为17.14％;通过单因素和正交实验，确定了微波辅助热水热水提取草菇多糖的最优工艺条件:微波功率400W，70℃微波20 min，80℃水浴继续提取4h，多糖平均得率为27.96％;通过单因素和均匀设计实验，确定了木瓜蛋白酶法提取草菇多糖的最优工艺条件:酶添加量0.2％，pH为6.5，62℃酶解2h，实际多糖得率为23.51％。对比三种提取方法的最高多糖得率，微波辅助热水提取法优于木瓜蛋白酶提取法优于热水提取法。
　　2.对草菇多糖分离纯化工艺进行了研究，主要探讨了Sevag法和中性蛋白酶-Sevag法对除蛋白的影响，活性炭法和H2O2法对脱色的影响。结果表明，中性蛋白酶-Sevag法除蛋白效果较佳，酶添加量40％，45℃酶解2h后，用Sevag试剂脱蛋白2次，蛋白脱除率为92.21％，多糖保留率为78.32％;H2O2法脱色效果较好，pH为9，H2O2添加量20％，60℃脱色3h，脱色率为99.45％，多糖保留率为69.12％。采用DEAE-52纤维素离子交换柱和Sephadex G-100凝胶色谱柱对草菇多糖进行分级纯化，得到VVP-1、VVP-2和VVP-3三个组分，紫外可见光谱扫描显示样品可能含蛋白。
　　3.对草菇多糖的生物活性进行了研究，主要探究了草菇多糖体外抗氧化能力、免疫调节活性及对抑制肝癌HepG2细胞增殖的影响。体外抗氧化实验结果表明，草菇多糖具有较弱的DPPH·自由基、O2-·自由基清除能力和还原能力，较强的.OH自由基清除能力。多糖样品清除DPPH·和·OH自由基活性顺序为VVP＞VVP-1＞VVP-2＞VVP-3;多糖样品清除O2-·自由基及还原能力随着浓度变化而变化，在高浓度6mg/mL时，活性大小顺序为VVP-2＞VVP-1＞VVP-3。体外细胞实验表明，草菇多糖具有体外促进巨噬细胞和脾淋巴细胞增殖的作用，活性顺序为VVP＞VVP-1＞VVP-2＞VVP-3;还具有体外抑制肝癌HepG2细胞增殖的效果，VVP-2较VVP-1、VVP-3表现出更强的活性。
　　4.对草菇多糖的结构进行了初步分析，主要通过SEM电镜扫描、薄层层析、GC-MS、IR扫描、高碘酸氧化、NMR等手段对多糖结构进行分析。电镜结果显示VVP呈海绵状，VVP-1呈光滑片状，VVP-2呈树枝状;单糖组成分析结果表明VVP-1和VVP-2均是由阿拉伯糖、木糖、果糖、半乳糖、葡萄糖及甘露糖组成;VVP-1和VVP-2的红外光谱图相似，两者均具有多糖的特征吸收峰，为吡喃糖化合物;高碘酸氧化结果表明，VVP-1和VVP-2中同时存在不同比例的1→6连接和1→2或1→4连接;13CNMR图谱结果说明VVP-1为同时含有α和β构型的吡喃糖，VVP-2为主要含有β构型的吡喃糖。

目录

摘要

第一章 绪论

1．1 多糖的提取、分离和纯化

1．2 多糖的生物活性

1．3 多糖的结构分析

1．4 草菇多糖国内外研究现状

1．5 本课题研究的目的、意义及主要内容

参考文献

第二章 草菇多糖的提取工艺优化

2．1 实验材料

2．1．1 实验原料

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要仪器

2．2 实验方法

2．2．1 多糖提取工艺流程

2．2．2 多糖含量测定

2．2．3 热水浸提法提取草菇多糖工艺

2．2．4 微波辅助热水提取草菇多糖工艺

2．2．5 木瓜蛋白酶法提取草菇多糖工艺

2．3 结果与分析

2．3．1 响应面优化热水浸提草菇多糖工艺研究

2．3．2 正交优化微波辅助热水提取草菇多糖工艺研究

2．3．3 均匀实验设计优化木瓜蛋白酶法提取草菇多糖的工艺研究

2．4 讨论

本章小结

参考文献

第三章 草菇多糖的分离纯化

3．1 实验材料

3．1．1 实验原料

3．1．2 主要试剂

3．1．3 主要仪器

3．2 实验方法

3．2．1 蛋白质含量的测定

3．2．2 多糖含量的测定

3．2．3 脱色率的测定

3．2．4 除蛋白的方法

3．2．5 除色素的方法

3．2．6 DEAE-52柱层析纯化

3．2．7 纯度鉴定

3．3 结果与分析

3．3．1 Sevag法脱蛋白

3．3．2 中性蛋白酶与Sevag联用法脱除蛋白质工艺

3．3．3 两种脱蛋白工艺比较

3．3．4 活性炭脱色工艺研究

3．3．5 H2O2氧化脱色工艺研究

3．3．6 两种脱色工艺比较

3．3．7 DEAE-Cellulose 52柱层析纯化

3．3．8 纯度鉴定

3．4 讨论

本章小结

参考文献

第四章 草菇多糖的生物活性研究

4．1 实验材料

4．1．1 实验原料

4．1．2 主要试剂

4．1．3 主要仪器

4．2 实验方法

4．2．1 草菇多糖体外抗氧化性研究

4．2．2 草菇多糖的免疫调节活性测定

4．2．3 草菇多糖对抑制肝癌HepG2细胞增殖的影响

4．3 结果与分析

4．3．1 草菇多糖的体外抗氧化性

4．3．2 草菇多糖的免疫调节活性

4．4 讨论

本章小结

参考文献

第五章 草菇多糖的结构分析

5．1 实验材料

5．1．1 实验原料

5．1．2 主要试剂

5．1．3 主要仪器

5．2 实验方法

5．2．1 SEM电镜扫描

5．2．2 薄层层析法

5．2．3 GC-MS分析

5．2．4 红外光谱扫描

5．2．5 高碘酸钠氧化

5．2．6 核磁共振分析

5．3 结果与分析

5．3．1 SEM电镜扫描图谱分析

5．3．2 薄层层析鉴定

5．3．3 GC-MS分析

5．3．4 红外扫描光谱分析

5．3．5 高碘酸钠氧化

5．3．6 核磁共振13CNMR图谱分析

5．4 讨论

本章小结

参考文献

全文结论

附录

致谢

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