ZEA对SC细胞周期分布的影响及自噬的作用

摘要

玉米赤霉烯酮(ZEA)又称F-2毒素，该毒素广泛存在于动物饲料以及人们的食粮中，其中ZEA的生殖发育毒性、免疫毒性对畜牧业的发展和全人类的健康具有潜在威胁。近年来，ZEA的雄性生殖毒性越来越受到人们的关注，但到目前为止，有关ZEA雄性生殖毒性及其毒性机理认识与研究仍存在不足。众所周知，睾丸支持细胞(Sertolicells，SC)的数量不仅为成年雄性动物睾丸的发育提供营养物质，还影响其生精能力，SC细胞在精子发生过程中起着不可替代的作用。本试验通过建立体外模型，利用透射电镜、流式细胞术和western-blot等技术，研究了ZEA对SC细胞周期分布的影响及自噬的作用，旨为揭示ZEA雄性生殖毒性的机理。
　　1、ZEA对SC细胞周期分布的影响。以原代大鼠SC细胞为材料，利用CCK-8法检测了ZEA对SC细胞活率的影响并筛选出小于40μmol/L的ZEA为使用浓度，随后选取不同浓度ZEA（0，0.1、1、10、20、30μmol/L）处理24h，利用流式细胞术、免疫荧光技术和Western-blot等细胞周期分布及细胞周期相关蛋白的影响。结果显示:相比较与对照组，随着ZEA浓度的升高，ZEA处理组SC细胞活力均受到显著或极显著性抑制，(P＜0.05或P＜0.01);当ZEA浓度高于10μmol/L时，G0/G1期比例显著下降(P＜0.05)、G2/M期的比例极显著升高(P＜0.01);10μmol/L ZEA及以上剂量组均极显著上调p-Cdc2/Cdc2、下调CyclinB1、Cdc25B、p-Histone H3等蛋白表达水平(P＜0.01);免疫荧光法检测的细胞有丝分裂期的Maker蛋白p-Histone H3表达的结果与免疫印迹结果一致。结果表明:ZEA可以通过影响G2期调控点关键因子——CyclinB1的表达、p-Cdc2/Cdc2激酶和Cdc25B磷酸酶的活性来抑制体外培养中SC细胞的增殖，并将细胞周期阻滞在G2期。
　　2、ZEA对SC细胞自噬的影响。用不同浓度的ZEA(0，0.1、1、10、20、30μmol/L)处理大鼠原代SC细胞24h后，免疫荧光法、透射电镜、Western-blot等技术检测了ZEA对SC细胞细胞自噬水平诱导的影响。结果显示:20μmol/L的ZEA处理SC细胞可导致细胞胞质内自噬体形成;随着ZEA浓度的升高，SC细胞内LC3聚点数增多，各染毒组均较对照组有极显著差异(P＜0.01);用单丹磺酰尸胺(MDC)染色法观察晚期自噬溶酶体的变化，发现各染毒组细胞内酸性囊泡的数目均较对照组极显著增多(P＜0.01)，且呈剂量依赖性;与对照组相比，p62蛋白表达显著下降，当ZEA的浓度达到10μmol/L时Atg5的表达量逐渐减少，各染毒组均较对照组有显著或极显著差别(P＜0.05或P＜0.01);各染毒组细胞自噬相关蛋白LC3Ⅱ、Beclin-1、Atg7的表达显著升高(P＜0.05或P＜0.01)。为进一步检测细胞自噬流的状态，试验使用自噬晚期抑制剂巴弗洛霉素A1(bafilomycin A1，Baf A1)刺激细胞，结果显示，Bafilomycin A1+20μmol/LZEA组LC3蛋白表达量较单独Bafilomycin A1处理组的表达量呈差异极显著升高(P＜0.01)，但泛素化蛋白p62的降解较ZEA单独处理组呈差异极显著降低(P＜0.01)。结果表明，ZEA对SC细胞产生细胞毒性，并诱导SC细胞发生自噬。
　　3、PI3K/Akt/mTOR信号通路在ZEA诱导SC细胞自噬中的作用。用不同浓度的ZEA（0、0.1、1、10、20μmol/L）的ZEA处理大鼠原代SC细胞24h，利用免疫印迹法检测PI3K/Akt/mTOR通路中关键蛋白的磷酸化水平;为进一步探究该信号通路在ZEA在SC细胞自噬诱导中的作用，随后加入PI3K通路抑制剂LY294002(10μmol/L)与20μmol/LZEA单独或联合处理细胞24h，通过western-blot、免疫荧光法检测Akt、m TOR蛋白磷酸化水平和LC3含量的变化，以及细胞内LC3的聚点现象。结果显示:随着ZEA浓度的上升，PI3K、mTOR、P70S6K、GSK2β蛋白的磷酸化水平逐渐下降，20μmol/L时各蛋白磷酸化水平较对照组有显著或极显著差异(P＜0.05或P＜0.01);与ZEA组比较，LY294002与ZEA联合组细胞Akt、mTOR蛋白磷酸化水平极显著下降(P＜0.01)，LC3Ⅱ表达量呈极显著升高(P＜0.01)，细胞内LC3聚点数量显著升高，荧光强度显著增强。结果表明:ZEA可以通过启动并下调PI3K/AKT/mTOR信号通路，该信号通路的启动在ZEA诱导SC细胞自噬中起负调控作用。
　　4、ZEA诱导的自噬以及PI3K/AKT/mTOR信号通路的启动在SC细胞周期分布中作用。为探讨自噬在ZEA对SC细胞周期影响中的作用及自噬影响ZEA对SC细胞周期分布的具体机制，试验分别采用ZEA(20μmol/L)与自噬抑制剂-氯喹(CQ)、促进剂-雷帕霉素(RAPA)、以及自噬相关通路PI3K通路抑制剂(LY294002)联合处理SC细胞后，利用流式细胞术、免疫荧光技术和Western-blot等技术检测了细胞周期分布、周期相关蛋白等的表达。结果显示:与ZEA组相比，CQ+ZEA组细胞周期的G2/M期的比例降低(P＜0.05)，RAPA+ZEA组细胞周期的G2/M期的比例升高(P＜0.05);CQ+ZEA组CyclinB1、Cdc2/p-Cdc2等蛋白的表达量降低(P＜0.05)，RAPA+ZEA组显著升高(P＜0.05)。与ZEA组相比，LY294002+ZEA组细胞G2/M期阻滞的比例降低(P＜0.05)，细胞周期关键激酶Cdc2/p-Cdc2的活性增强（P＜0.05）。结果表明，启动并下调自噬相关通路PI3K/Akt/mTOR后，可以部分逆转ZEA诱导SC细胞G2/M期的阻滞。
　　结论认为，ZEA能抑制细胞增殖，影响SC细胞的周期的分布，并诱导G2期阻滞;在一定浓度范围内，ZEA可以通过启动并下调PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导细胞自噬的发生，从而部分逆转ZEA诱导SC细胞G2/M期的阻滞。

目录

摘要

缩略语表

第一章 文献综述

1 玉米赤霉烯酮的理化性质

2 玉米赤霉烯酮的毒性研究进展

2．1 玉米赤霉烯酮的生殖与发育毒性

2．2 玉米赤霉烯酮的免疫毒性

2．3 玉米赤霉烯酮的致瘤性

2．4 玉米赤霉烯酮的肝毒性与肾毒性

3 玉米赤霉烯酮的生殖毒性机理研究进展

3．1 激素介导效应

3．2 诱导细胞凋亡

3．3 氧化应激

4 细胞周期及其主要调控因子

4．1 细胞周期

4．2 细胞周期的主要调控因子

5 自噬

5．1 自噬的分类

5．2 自噬发生的过程

5．3 自噬的调控

5．4 PI3K／Akt／m TOR信号转导通路

6 研究目的及意义

第二章 ZEA对SC细胞周期分布的影响

1 材料与方法

1．1 试验动物

1．2 主要试剂与仪器

1．3 溶液的配制

1．4 SC细胞分离与培养

1．5 CCK-8法检测ZEA对SC细胞活率的影响

1．6 流式细胞术分析ZEA对SC细胞周期分布的影响

1．7 免疫荧光方法检测磷酸化组蛋白H3(p-Histone H3)的表达情况

1．8 Western Blot检测细胞周期相关蛋白的表达

1．9 数据的统计与分析

2 结果

2．1 ZEA对SC细胞活率的影响

2．2 ZEA对SC细胞周期的影响

2．3 ZEA对细胞周期G2期标志性蛋白表达的影响

2．4 ZEA对SC细胞磷酸化组蛋白H3(p-Histone H3)表达的影响

3 讨论

第三章 ZEA对SC细胞自噬的影响

1 材料与方法

1．1 试验动物

1．2 主要试剂与仪器

1．3 透射电镜检测自噬体

1．4 MDC染色检测自噬囊泡

1．5 免疫荧光法观察SC细胞中自噬LC3聚点

1．6 Western-blot检测自噬相关蛋白LC3等的表达

1．7 数据的统计与分析

2 结果

2．1 ZEA染毒后SC细胞自噬体形成情况

2．2 ZEA染毒后SC细胞自噬囊泡形成情况

2．3 ZEA诱导SC细胞中自噬LC3聚点的形成

2．4 ZEA对LC3 Ⅱ、Beclin-1、p62等自噬体标志性蛋白的影响

2．5 ZEA诱导的自噬流检测

3 讨论

第四章 PI3K／Akt／m TOR信号通路在ZEA诱导SC细胞自噬中的作用

1 材料与方法

1．1 试验动物

1．2 主要试剂与仪器

1．4 免疫荧光检测PI3K抑制剂处理SC后自噬LC3聚点

1．5 统计学分析

2 结果

2．2 PI3K／Akt／m TOR信号通路在ZEA诱导SC细胞中自噬LC3聚点的作用

2．3 PI3K／Akt／mTOR信号通路对p-Akt／Akt、P-mTOR／mTOR、LC3Ⅱ／LC3Ⅰ、p62表达的影响

3 讨论

第五章 ZEA诱导的自噬在SC细胞周期分布中作用

1．5 流式细胞术分析PI3K／Akt／m TOR信号通路对细胞周期的影响

1．6 Western Blot检测细胞周期相关蛋白的表达

1．7 数据的统计与分析

2 结果

2．1 自噬在ZEA对SC细胞周期影响中的作用

2．2 自噬对ZEA诱导SC细胞周期蛋白表达的影响

2．3 PI3K／Akt／m TOR通路在ZEA对SC细胞周期影响中的作用

2．4 PI3K抑制剂对G2／M期标志性蛋白表达的影响

3 讨论

全文结论

致谢

攻读学位期间发表论文

参考文献

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