DNA-PKcs在放射诱发HeLa细胞自噬中的作用及抑制自噬对细胞周期检查点的影响研究

摘要

DNA依赖的蛋白激酶催化亚基(DNA-dependent kinase catalytic subunit, DNA-PKcs)是一个分子量大约为460kD的蛋白激酶，其属于磷脂酰肌醇-3-激酶相关蛋白激酶家族成员，是一种被 DNA激活的丝氨酸/苏氨酸激酶，其与KU70/KU80组成的异源二聚体调节亚基一起组成了异源三聚体DNA依赖的蛋白激酶（DNA-dependent kinase, DNA-PK）。DNA-PKcs的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性不仅可以激活调节损伤修复的相关蛋白和参与细胞周期调控的蛋白，而且还可以通过自身活化的方法调节其激酶活性。研究证实DNA-PKcs是一个具有多功能性的酶，其最主要的也是人们研究最透彻的一个功能就是通过非同源末端修复途径参与DNA双链断裂损伤修复。除此之外，DNA-PKcs的沉默或缺失还会引起电离辐射或化学药物引起的细胞不正常的分裂，细胞非正常的G1期或G2/M期阻滞和自噬。近年来随着对DNA-PKcs研究的不断研究，发现其在肿瘤组织中的表达要超出正常范围。很多研究已经表明DNA-PKcs的抑制是一个增加肿瘤细胞对抗电离辐射，肿瘤试剂拓扑异构酶 II毒性物质和顺铂等敏感性的非常可行的方法。有研究表明，DNA-PKcs在胶质瘤细胞中参与电离辐射诱发自噬的调节，但是关于DNA-PKcs如何调节自噬的研究很少。
　　细胞自噬是真核细胞中非常关键且保守的物质的分解与循环利用的过程，有助于降解细胞内长寿命的蛋白质，细胞溶质的成分，损伤老化的细胞器以及某些病原体使得它们得以循环重复利用，从而有助于保持细胞的内稳态，这是自噬最基本的作用。在面对错乱复杂的环境比如必需营养物质的缺乏，电离辐射以及内源性的活性氧，复制压力等，机体的细胞需要作出各种反应来应对不利环境，自噬会通过消耗自身的物质来使细胞获得临时的供应从而促进细胞存活。但是，细胞自噬在肿瘤的治疗过程中依然是一个十分有争议的话题，因为自噬可以刺激细胞存活，也可以诱导细胞死亡。研究表明当细胞遭遇某一种生理变化或者某一种特殊的处理比如致死性的药物剂量，细胞自噬就可以促进细胞的死亡。研究证实自噬的功能失调与许多疾病的起始和发展有很大关系。3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3MA）是一个被研究学者广泛使用的细胞自噬抑制剂，主要作用能够通过抑制细胞自噬的正性调节子Ⅲ型PI3K来抑制自噬。
　　目的：
　　1.以DNA-PKcs敲低的HeLa细胞系为对象，观察照射后细胞的放射敏感性以及自噬蛋白的表达情况，探讨DNA-PKcs调节自噬作用及其可能的分子机制；
　　2.电离辐射可以诱发宫颈癌HeLa细胞G2/M期的周期阻滞，探讨自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤在电离辐射诱发HeLa周期阻滞中的调节作用。
　　方法：
　　利用实验室前期构建的DNA-PKcs沉默的表达载体，采用慢病毒介导的小干扰RNA技术，通过Lipofectamin2000作为介质，包装慢病毒颗粒并感染HeLa细胞，使用嘌呤霉素抗性筛选获得稳定敲低DNA-PKcs的宫颈癌HeLa细胞系，并且经过免疫印迹鉴定；Hela-shNC和 Hela-shDNA-PKcs经过单独照射或者与自噬的抑制剂3-甲基腺嘌呤联合作用处理细胞，在照射后不同时间点（0、12、24、48和72h）采用细胞增殖与毒性试验检测细胞的增殖与细胞的放射敏感性变化；HeLa细胞经过单独照射或者与自噬的抑制剂3-甲基腺嘌呤联合作用处理，通过细胞平板克隆形成实验检测照射后 HeLa-shNC和HeLa-shDNA-PKcs在不同剂量射线下存活率变化；通过流式细胞术检测6Gy照射后0、2、4、6、8和12h后的细胞周期变化及有丝分裂期磷酸化组蛋白H3的变化；DNA-PKcs的激酶抑制剂NU7026与自噬的激动剂雷帕霉素共同处理细胞并通过免疫印迹实验检测多功能的泛素结合蛋白P62、微管轻链蛋白LC3、哺乳动物雷帕霉素的靶蛋白mTOR并且HeLa经过单独照射或者与自噬的抑制剂3-甲基腺嘌呤联合作用处理，通过免疫印迹检测周期检验点激酶2（Chk2），Cdk1及磷酸化酶Cdc25C的变化；利用分子克隆技术构建GFP-LC3表达载体并通过激光共聚焦免疫荧光技术检测绿色荧光GFP-LC3焦点的形成。
　　结果：
　　1.免疫印迹验证HeLa-shNC和HeLa-shDNA-PKcs，发现DNA-PKcs在敲低细胞中表达很少，这说明DNA-PKcs稳定敲低的细胞系构建成功；
　　2.细胞增殖与毒性检测结果显示，DNA-PKcs敲低的细胞放射敏感性增强，细胞的增殖速度减慢；在照射处理的基础上在细胞中加入自噬的抑制剂3-甲基腺嘌呤，无论是对照细胞还是DNA-PKcs敲低的细胞，其细胞的放射敏感性进一步增强；
　　3.免疫印迹结果得到：与Hela-shNC而言，DNA-PKcs敲低的细胞中，微观相关蛋白LC3蛋白表达增多而p62蛋白表达减少， mTOR在2481位点的磷酸化水平下调；
　　4.使用自噬的激动剂雷帕霉素和DNA-PKcs的激酶抑制剂NU7026处理Hela细胞，通过免疫印迹实验得到DNA-PKcs的激酶活性被抑制后，细胞自噬蛋白LC3表达增加且加入雷帕霉素后自噬水平进一步增加；
　　5.激光共聚焦免疫荧光法得到 DNA-PKcs蛋白敲低后，平均每个细胞的GFP-LC3荧光斑点数目增多，加入自噬的抑制剂3MA细胞自噬被抑制，加入自噬促进物RAPA，细胞自噬增加；
　　6.细胞经过6Gy照射处理并通过流式细胞术检测在照射后不同时间细胞周期的变化，
　　发现细胞周期被阻滞在G2/M期，这与实验室前期的实验结果一致；在照射的基础上辅以自噬的抑制剂3-甲基腺嘌呤发现细胞的阻滞现象被破坏，这说明3MA参与了电离辐射诱导的周期阻滞的调节；
　　7.细胞经过照射和自噬的抑制剂3-甲基腺嘌呤共同处理，通过流式细胞术检测3-甲基腺嘌呤处理后磷酸化的组蛋白H3表达增多，这说明3MA可以促进细胞从G2期进入到M期；
　　8.免疫印迹检测在不同的时间点细胞周期相关蛋白，发现在加入自噬的抑制剂3-甲基腺嘌呤后，磷酸化的ATM(S1981)、Chk2(T68)，Cdc2(T15)和 Cdc25C(S216)蛋白的水平均有所下调。
　　结论：
　　1. DNA-PKcs蛋白敲低后细胞的放射敏感性增加且电离辐射诱发的细胞自噬增加；
　　2. DNA-PKcs可能是通过mTOR信号通路来调节自噬；
　　3.3-甲基腺嘌呤通过 ATM/Chk2/Cdc25c/Cdk1的信号通路来调节电离辐射诱发的细胞周期G2/M检查点功能。

目录

声明

中英文缩略词表

前言

材料与方法

1. 材料

2. 实验方法

结果

第一部分 DNA-PKcs在电离辐射诱发HeLa细胞自噬中的作用研究

第二部分 抑制自噬对细胞周期检查点的影响研究

讨论

4.1 DNA-PKcs在电离辐射诱发HeLa细胞自噬中的作用研究

4.2 3MA在细胞周期中的调节机制

结论

参考文献

代表性论文

个人简历

致谢