发酵乳杆菌grx07发酵剂的制备及冻干保护机制的研究

摘要

乳酸菌因其具有良好的发酵和益生特性，备受消费者的青睐，2017年中国乳酸菌制品的市场份额已经超过乳制品的一半。高活力乳酸菌发酵剂的研制具有重要的现实意义，不仅能减少对进口发酵剂的依赖，还能保护自主知识产权。以人源发酵乳杆菌grx07为研究对象，研究并优化其高密度培养基和培养工艺;研究乳酸菌冻干损伤保护机制，并优化冻干保护剂、预培养条件及贮藏条件，最终得到活菌数高、活力高、货架期长的乳酸菌冻干发酵剂。研究结果具体如下:
　　对水解脱脂乳培养基进行了研究，研究了脱脂乳不同水解度对grx07生长代谢特性的影响。结果表明以水解度为15％的脱脂乳培养grx07，grx07蛋白酶活力最高为23U/mL、生长速率最高达到1.8g/L·h，37℃培养24h后水解液中乳糖的利用率为77.06％，发酵底物向菌体的转化率最高，活菌数最高达到1.07×1010cfu/mL。利用水解度为15％的脱脂乳为基础培养基，复配其他碳氮源和缓冲盐类作为改良培养基，37℃培养24h后活菌数最高达到1.2×1010cfu/mL。
　　对grx07高密度培养进行了研究，以活菌数为考察指标，优化了影响grx07生长的气体保护、恒pH培养、补料培养等策略。最终确定中和培养的工艺为:利用改良培养基，通入氮气，37℃搅拌培养，发酵过程中流加混合碱液调节发酵液pH值4.9，最终活菌数达到2.52×1010cfu/mL。恒pH补料培养的工艺为:发酵液中糖浓度降至5-8g/L时开始补料，维持发酵液中糖浓度5-8g/L，补料液的碳氮比为1∶1。在此培养条件下活菌数达到4.2×1010cfu/mL，较分批培养提高了2.5倍。
　　对grx07冻干保护剂的配方和保护机制进行了研究，采用PB实验筛选出对冻干存活率有显著影响的元素，然后通过BB实验优化保护剂的配方。研究表明最优保护剂为:脱脂乳12.71％、蔗糖11.88％、谷氨酸钠4.22％、甘油2.95％，菌体冻干存活率达到了94.23％。冻干对grx07中酶的影响结果为:对HK和PK无显著影响(p＞0.05)，对β-Gal、LDH和ATP酶具有显著影响(p＜0.05)，利用优化的保护剂，β-Gal、LDH和ATP酶活力均有显著性提高(p＜0.05)。冻干对细胞膜完整性造成破坏，改变了细胞膜的流动性和通透性，使得胞内Ca2+流失，优化的保护剂对细胞膜的损伤有很好的保护作用。
　　优化并探究了预培养对grx07冻干的影响，对保护剂和菌泥比例、预培养温度、预培养时间三个因素进行旋转正交优化。结果表明当保护剂和菌泥比例为1∶1，预培养温度为40℃，预培养时间为60min时，grx07活菌数较未预培养提高了31.51％。预培养不仅能提高冻干存活率，还能提高冻干后菌体相关酶活力、减少细胞膜的损伤。
　　研究了不同温度对grx07发酵剂贮藏相关特性的影响，探讨了grx07发酵剂在贮藏期间水分活度、活菌数、相关酶活力的变化。20℃贮藏能降低酶活，加快菌体的死亡;-20℃贮藏对grx07发酵剂有很好的保护作用。

目录

摘要

1 绪论

1．1 乳酸菌

1．2 发酵乳杆菌

1．2．1 发酵乳杆菌简介

1．2．2 发酵乳杆菌益生特性

1．3 乳酸菌高密度培养

1．3．1 高密度发酵培养基

1．3．2 乳酸菌高密度培养条件

1．3．3 乳酸菌高密度培养方法

1．3．4 发酵乳杆菌培养研究进展

1．4 乳酸菌真空冷冻干燥

1．4．1 乳酸菌冻干发酵剂研究进展

1．4．2 乳酸菌冻干生理损伤研究进展

1．4．3 冻干过程中影响乳酸菌活力的因素

1．4．4 冻干过程中存在的问题

1．5 研究方案

1．5．1 研究目的及意义

1．5．2 研究方法和试验设计

2 水解脱脂乳培养基对乳杆菌grx07生长代谢特性的影响

2．1 实验材料与设备

2．1．3 主要仪器及设备

2．2 实验方法

2．2．1 菌种的活化和培养

2．2．2 脱脂乳水解液的制备

2．2．3 活菌数测定

2．2．4 发酵液乳酸含量的测定

2．2．5 还原糖含量的测定

2．2．6 乳酸菌蛋白酶活力的测定

2．2．7 乳酸菌生长模型和产酸模型的建立

2．2．8 不同培养基乳酸菌生长对照实验

2．2．9 数据统计分析

2．3 结果与分析

2．3．1 脱脂乳水解度对乳杆菌grx07生长及代谢的影响

2．3．2 脱脂乳水解度对发酵液中残糖的影响

2．3．3 脱脂乳水解度对乳杆菌grx07蛋白酶活力的影响

2．3．4 脱脂乳水解度对乳杆菌grx07生长及产酸速率的影响

2．3．5 不同培养基对乳杆菌grx07生长的影响

2．4 本章小结

3 高密度发酵工艺的优化

3．1 实验材料与设备

3．1．1 主要药品与试剂

3．1．2 培养基

3．1．3 主要仪器及设备

3．2 实验方法

3．2．1 活菌数测定

3．2．2 溶液中还原糖含量的测定

3．2．3 发酵液pH测定

3．2．4 气体及搅拌对乳杆菌grx07培养的影响

3．2．5 中和培养的优化

3．2．6 恒pH残糖反馈补料实验

3．2．7 补料液最适碳氮比的确定

3．2．8 补料培养与分批培养的对比

3．2．9 数据统计分析

3．3 结果与分析

3．3．1 气体及搅拌对乳杆菌grx07生长的影响

3．3．2 中和培养的优化

3．3．3 恒pH残糖反馈补料培养优化

3．3．4 补料液碳氮比的确定

3．3．5 补料培养与分批培养的对比

3．4 本章小结

4 保护剂对乳杆菌grx07冻干损伤保护机制的研究

4．1 实验材料与设备

4．1．1 主要药品与试剂

4．1．2 主要仪器及设备

4．2．1 离心条件的优化

4．2．2 乳酸菌冻干工艺

4．2．3 冻干保护剂的筛选

4．2．4 冻干保护剂优化试验设计

4．2．5 菌体存活率的测定

4．2．6 粗酶液的制备

4．2．7 β-半乳糖苷酶活力的测定

4．2．8 乳酸脱氢酶活力的测定

4．2．9 丙酮酸激酶活力的测定

4．2．10 己糖激酶活力的测定

4．2．11 ATP酶活力的测定

4．2．12 细胞膜流动性的测定

4．2．13 细胞膜完整性的测定

4．2．14 胞内Ca2+离子含量的测定

4．2．15 数据统计分析

4．3 结果与分析

4．3．1 离心条件的优化

4．3．2 冻干保护剂的筛选

4．3．3 保护剂各成分添加量的优化

4．3．4 复合冻干保护剂的选择

4．3．5 不同保护剂对乳杆菌grx07 β-半乳糖苷酶活力的影响

4．3．6 不同保护剂对乳杆菌grx07乳酸脱氢酶酶活力的影响

4．3．7 不同保护剂对乳杆菌grx07丙酮酸酶活力的影响

4．3．8 不同保护剂对乳杆菌grx07己糖激酶活力的影响

4．3．9 不同保护剂对乳杆菌grx07 ATP酶活力的影响

4．3．10 不同保护剂对乳杆菌grx07细胞膜流动性的影响

4．3．11 不同保护剂对乳杆菌grx07细胞膜完整性的影响

4．3．12 不同保护剂对乳杆菌grx07胞内Ca2+含量的影响

4．4 本章小结

5 乳杆菌grx07预培养条件的优化

5．1 实验材料与设备

5．1．1 主要药品与试剂

5．1．2 主要仪器及设备

5．2 实验方法

5．2．1 预培养条件的优化

5．2．2 乳酸菌活菌数提高率的测定

5．2．3 相关酶活的测定

5．2．4 细胞膜相关特性的测定

5．2．5 数据统计分析

5．3 结果与分析

5．3．1 菌泥与保护剂混合比例对乳杆菌grx07提高率的影响

5．3．2 预培养温度对乳杆菌grx07提高率的影响

5．3．3 预培养时间对乳杆菌grx07提高率的影响

5．3．4 预培养条件旋转正交优化

5．3．5 预培养对冻干乳杆菌grx07 β-半乳糖苷酶活力的影响

5．3．7 预培养对冻干乳杆菌grx07ATP酶活力的影响

5．3．8 预培养对冻干乳杆菌grx07细胞膜流动性的影响

5．3．9 预培养对冻干乳杆菌grx07细胞膜完整性的影响

5．3．10 预培养对冻干乳杆菌grx07胞内Ca2+浓度的影响

5．4 本章小结

6 贮藏温度对发酵剂活力的影响

6．1 实验材料与设备

6．1．1 主要药品与试剂

6．1．2 主要仪器及设备

6．2 实验方法

6．2．1 冻干发酵剂的制备

6．2．2 活菌数的和存活率的计算

6．2．3 水分含量和水分活度的测定

6．2．4 乳酸菌发酵活力的测定

6．2．5 相关酶的测定

6．2．6 数据处理

6．3 实验结果与分析

6．3．1 贮藏温度对发酵剂活菌数的影响

6．3．2 贮藏温度对发酵剂水分活度的变化

6．3．3 贮藏温度对乳杆菌grx07发酵活力的影响

6．3．4 贮藏温度对乳杆菌grx07乳酸脱氢酶活力的影响

6．3．5 贮藏温度对乳杆菌grx07 β-半乳糖苷酶活力的影响

6．3．6 贮藏温度对乳杆菌grx07 ATP酶活力的影响

6．4 本章小结

7 结论与展望

7．1 结论

7．2 展望

参考文献

致谢

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