发酵法生产谷胱甘肽及其高产策略研究

摘要

谷胱甘肽(GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸缩合形成的三肽化合物,广泛分布于自然界的生物体中,在活细胞内具有清除自由基、抗氧化、解毒等生理功能。近年来,随着研究的不断深入,GSH在临床医药、食品加工、化妆品以及畜牧生产中都将具有良好的应用前景。
　　 微生物发酵法是目前GSH工业化生产最具竞争力的方法之一。本论文以GSH积累株Candida utilis SZU07-01为出发菌株,以实现GSH发酵的高产量、高得率及高生产强度为目标,首先研究了培养基中碳氮比对GSH生物合成的影响,之后在5L发酵罐中比较了恒速补料和指数补料方式对GSH发酵生产的影响。在此基础上模拟了多项式补料方式,并将其运用于GSH的高密度发酵生产。为了进一步提高GSH的总产量,研究了氨基酸的添加策略。本论文的主要研究内容如下:
　　 (1)摇瓶发酵条件下考查了氮源及碳氮比对细胞生长及GSH合成的影响,选择了分别对细胞生长和GSH合成具有明显优势的氮源,即尿素和硫酸铵。进而,分别以两者为单一氮源考查了相应发酵条件下的最佳碳氮比。以硫酸铵为氮源时,最佳C/N比为8.3 mol/mol；而以尿素为氮源时,最佳C/N比却为5.6 mol/mol。
　　 (2)分析了氮源的利用率与GSH生物合成的关系,发现在单一氮源和混合氮源条件下,氮源利用率均在30％左右最佳。两种单一氮源条件下的分批培养实验结果表明,尿素在促进细胞生长和GSH合成方面均有优势,并采用发酵动力学模型对GSH分批发酵结果进行了定量分析与解释。
　　 (3)通过分批培养确定了发酵初始葡萄糖浓度为26.0 g/L,进而考查了恒速流加和指数流加补料方式对GSH生物合成的影响。在此基础之上,模拟了多项式流加策略,并在总糖浓度为200 g/L的前提下将其应用于细胞的高密度发酵过程。最终细胞干重和GSH产量分别达到91.20 g/L和825.0 mg/L,大大提高了细胞和GSH的产量和生产强度。
　　 (4)摇瓶发酵条件下,考查了L-蛋氨酸添加对GSH合成的影响,发现L-蛋氨酸添加浓度为60 mmol/L肘,GSH产量和胞内GSH含量均有最明显提高。由于GSH是胞内产物,所以除了要获得较高的细胞密度之外,胞内GSH含量的积累也很重要。为此,在高密度发酵基础上,考查了添加L-半胱氨酸对GSH合成的影响,结果表明,在细胞生长停止之后,一次性添3n30 mmol/L的L-办胱氨酸效果最好,GSH最高产量为1104.3 mg/L,胞内GSH含量最高达到2.10％。
　　 (5)据此,采用前期添加160 mmol/L的L-蛋氨酸,细胞停止生长之后一次性添加30 mmol/L的L-半胱氨酸的氨基酸添加策略,使得最终GSH产量有了进一步提高,为1247.1 mg/L,胞内含量亦达到2.41％,GSH生产强度达到26.0 mg/(L·h)。