B7-H1和B7-H3在非小细胞肺癌中的表达及其在肿瘤免疫逃逸中作用和临床意义

摘要

肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。肺癌以非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)最为多见,约占肺癌总数的80％~87％。近年来NSCLC的治疗取得了一定进步,特别是药物治疗(如分子靶向治疗)获得一些可喜的成果。但NSCLC的5年生存率并未有显著改善,急需寻找有效的治疗手段。随着肿瘤免疫学机制研究的深入,一些肿瘤免疫治疗方法引入临床,但这些方法大多还处于探索阶段,对治疗肿瘤的疗效仍有限。
　　肿瘤免疫的许多机制仍需深入探讨研究,这对深入了解肿瘤发生和发展的规律,寻找更有效的治疗方法有重要意义。肿瘤的发生和转移与肿瘤细胞所处的内外环境有着密切关系。肿瘤微环境(tumor microenviroment)是肿瘤在其发生和发展过程中所处的内环境,由肿瘤细胞本身、间质细胞、微血管、组织液及一些浸润细胞(如树突状细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞等免疫细胞)共同组成。
　　肿瘤微环境中浸润的免疫细胞是机体识别与攻击肿瘤细胞发挥免疫防御的效应细胞。肿瘤细胞可通过修饰自身表面抗原、表达负性调控分子或分泌抑制因子来逃避免疫细胞的识别与攻击,获得免疫逃逸,从而得以发生和发展。T细胞是抗肿瘤免疫的主要免疫效应细胞,T细胞的活化有赖于双重信号的共同作用,分别是特异性抗原信号和共刺激分子信号。共刺激分子B7家族对激活和抑制T细胞免疫起着非常关键的作用。
　　共刺激分子不仅可提供起始、增强和维持T细胞免疫关键的正向第二信号,也可产生限制和减弱T细胞免疫反应的信号。T细胞免疫反应受抑是肿瘤获得免疫逃逸重要途径。B7-H1和B7-H3是B7家族的新成员,在多种肿瘤细胞株和肿瘤组织中有高表达,使其受到越来越多的关注。
　　多数研究显示,人类肿瘤表达的B7-H1是负性调控分子,有利于肿瘤的发生和发展,但其生物学作用机制仍需进一步探索。B7-H3在最初的研究中显示,能协同刺激CD4+、CD8+T细胞的增殖、增加细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性。但随后的研究发现,B7-H3亦可抑制T细胞的体外增殖,下调IFN-γ、TNF-α和GM-CSF等细胞因子的分泌。近期与临床相关的研究显示,肿瘤组织中B7-H3的表达与病情进展和预后差有关,但也有相反的报道。
　　因此,关于B7-H3的生物学功能还存在较大争议。目前有关B7-H1和B7-H3在肺癌组织中表达意义的研究不多,这两个分子在肺癌发生和发展中的生物学作用机制更需要进一步探索。INF-y是T细胞的重要的效应和调节因子。有研究表明INF-y有下调CXCR4的作用,CXCR4在肿瘤增殖、侵袭和转移过程起作用。TIA-1(T-cell intracellular antigen1)为溶细胞性颗粒蛋白,是CTL和NK细胞重要的溶细胞效应因子。目前普遍将TIA-1作为CTL和NK细胞的标志,并有研究发现在肿瘤进展时TIA-1+细胞在肿瘤组织中浸润减少。已有研究发现B7-H1和B7-H3对CTL和NK细胞有调节作用。
　　本研究将通过检测B7-H1、B7-H3和CXCR4在NSCLC组织中的表达水平及表达TIA-1和IFN-y的细胞在NSCLC组织中的浸润程度,结合体外细胞系研究,探讨B7-H1和B7-H3在NSCLC中表达的临床意义、以及B7-H1和B7-H3在NSCLC免疫逃逸中的可能作用机制。
　　目的：
　　检测共刺激分子B7-H1和B7-H3在非小细胞肺癌组织中的表达水平,探讨其表达的临床意义和其在肿瘤免疫逃逸中的可能作用机制。
　　方法：
　　1、收集2005年3月-2007年10月期间,手术切除的128例NSCLC组织标本,采用免疫组织化学染色方法,检测B7-H1、B7-H3和CXCR4在NSCLC组织中的表达水平及表达TIA-1和IFN-y细胞在NSCLC组织中的浸润程度。设计调查表,登记每位患者的临床和病理的相关信息,包括年龄、性别、手术时间、肿瘤部位、肿瘤大小、病理类型、分化程度、淋巴结转移和TNM分期等,同时对患者的生存情况进行随访。分析B7-H1、B7-H3和CXCR4在NSCLC组织中的表达水平及表达TIA-1和IFN-y细胞在NSCLC组织中的浸润程度与临床病理因素的相关性。
　　2、选择pGPU6/GFP/Neo质粒载体构建B7-H3 shRNA(a small hairpin RNA or short hairpin RNA)重组载体,用脂质体转染法将该重组载体转染B7-H3高表达肺腺癌细胞株H1299,建立B7-H3基因沉默细胞(H1299-B7-H3-KD)。选择pIRES2-EGFP质粒载体构建B7-H3表达重组载体,用脂质体转染法将该重组载体转染B7-H3低表达肺腺癌细胞株SPC-A1,建立B7-H3基因转染细胞(SPC-A1-B7-H3)。用3H-TdR掺入法检测B7-H3基因沉默细胞H1299-B7-H3-KD和基因转染细胞SPC-A1-B7-H3刺激T淋巴细胞的体外增殖效应。用ELISA方法检测其上清中INF-y的表达水平,流式细胞术分析刺激后T淋巴细胞的细胞周期变化。用流式细胞术及RT-PCR检测B7-H3基因沉默和基因转染细胞的B7-H3表达水平及IFN-y作用下肺腺癌细胞株H1299的CXCR4表达水平。用Transwell实验检测IFN-y对肺腺癌细胞株体外迁移能力的影响。
　　结果：
　　1、128例NSCLC组织中,93例(72.7％)高表达B7-H1,89例(69.5％)高表达B7-H3。癌旁组织中B7-H1主要为低表达;B7-H3在癌旁组织中为不表达或低表达。B7-H1、B7-H3在NSCLC组织中的高表达均显著高于癌旁组织(p＜0.001,0.001)。B7-H1、B7-H3在NSCLC组织的高表达都随着淋巴结转移和TNM分期升高而增高(p＜0.05,0.05),而与其它临床病理因素无显著相关性。
　　2、NSCLC组织中B7-H1和B7-H3的高表达呈显著性正相关(p＜0.05);128例NSCLC组织中有68例(53.1％)有B7-H1和B7-H3共表达现象,癌旁组织未发现B7-H1和B7-H3共表达现象;淋巴结转移患者B7-H1和B7-H3的共表达率(72.9％)显著高于无淋巴结转移患者(29.31％)(p＜0.001);随着TNM分期(Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ)的升高B7-H1和B7-H3的共表达率逐渐增高(26.7％,53.5％和82.5％)p＜0.001);B7-H1和B7-H3的共表达率与年龄、性别、病理类型、分化程度、肿块大小等均无显著相关性。
　　3、NSCLC组织中的TIA-1+细胞和IFN-y+细胞高浸润(47.7％,35.9％)显著高于癌旁组织(p＜0.01,0.01);癌旁组织中TIA-1+细胞和IFN-y+细胞均为低浸润;NSCLC组织中的TIA-1+和IFN-y+细胞高浸润率都随淋巴结转移和TNM分期升高而下降(p＜0.05,0.05,0.05,0.05),但见鳞癌患者的TIA-1+细胞高浸润(57.4％)明显高于腺癌(38.8％)患者(p＜0.05)。
　　4、NSCLC组织中的CXCR4高表达(55.5％)显著高于癌旁组织(p＜0.01);癌旁组织中CXCR4均为低表达;CXCR4的高表达随TNM分期升高而升高(p＜0.05)。
　　5、临床病理参数单因素生存分析显示:肿瘤低分化的患者的中位生存时间明显短于中、高分化患者(27.1 vs38.3 vs37.5个月)(p＜0.05);有淋巴结转移患者的中位生存时间明显短于无转移患者(22.9 vs59.2个月)(p＜0.01);随着TNM分期的升高,患者的中位生存时间逐渐缩短(69.7 vs33.5 vs13.5个月)(p＜0.01);男性患者的中位生存时间短于女性(33.5 vs53.8个月)(p=0.077);年龄、肿瘤大小和病理类型对患者的中位生存时间无显著性影响。
　　6、分子表达单因素生存分析显示:B7-H1高表达患者的中位生存时间明显短于低表达患者(28.7 vs60.6个月)(p＜0.01);B7-H3高表达患者的中位生存时间也明显短于低表达患者(25.0 vs60.6个月)(p＜0.01);TIA-1+细胞高浸润患者的中位生存时间明显长于低浸润患者(59.2 vs20.5个月)(p＜0.01);IFN-γ+细胞患者的中位生存时间明显长于低浸润患者(44.7 vs28.7个月)(p＜0.05);CXCR4高表达患者的中位生存时间短于低表达患者(28.7 vs40.7个月)(p=0.08);B7-H1和B7-H3都高表达时,中位生存时间最短(22.7个月),B7-H1和B7-H3都低表达时,中位生存时间最长(60.6个月),B7-H1高表达而B7-H3低表达时,中位生存时间(49.5个月),B7-H1低表达而B7-H3高表达,中位生存时间(37.1个月),组间比较有显著性差异(p＜0.01)。
　　7、生存的多因素分析显示:性别、TNM分期、B7-H1表达水平、B7-H3表达水平、TIA-1+细胞浸润程度是独立的预测因素(p＜0.05,0.05,0.05,0.05,0.01),男性、TNM分期高、B7-H1高表达、B7-H3高表达和TIA-1+细胞低浸润的NSCLC患者生存期短。
　　8、NSCLC组织中B7-H1和B7-H3的高表达与CXCR4高表达呈显著性正相关(p＜0.05,＜0.001)。TIA-1+细胞高浸润与B7-H3和CXCR4高表达呈显著性负相关(p＜0.05,0.05);与B7-H1高表达也呈负相关,但未达到统计学意义;而与IFN-γ+细胞高浸润呈显著性正相关(p＜0.05)。IFN-γ+细胞高浸润与B7-H1、B7-H3和高表达均呈负相关,但未达到统计学意义。
　　9、肺腺癌细胞株H1299在其B7-H3基因沉默后,能显著地促进T细胞的体外由CD3mAb和CD28mAb激发介导的增殖效应(p＜0.05),促进IFN-γ的分泌(p＜0.05);而转染B7-H3基因的肺腺癌细胞株SCP-A1,能显著地抑制T细胞的体外由CD3mAb和CD28mAb激发介导的增殖效应(p＜0.05),抑制IFN-γ的分泌(p＜0.05)。
　　10、IFN-γ能下调肺癌细胞株H1299细胞CXCR4分子表达;INF-γ与AMD3100(CXCR4阻滞剂)一样,能显著抑制CXCL12诱导H1299的迁移率(p＜0.001);H1299在其B7-H3基因被沉默后,其迁移生长的能力明显下降。
　　结论：
　　B7-H1和B7-H3在NSCLC的免疫应答中可能起负调控作用,这两个分子的高表达对NSCLC的发生和进展有促进作用。B7-H1和B7-H3高表达可能通过抑制NSCLC组织中表达TIA-1和INF-y的T淋巴细胞和/或NK细胞的浸润、增殖和分泌活性,导致TIA-1和INF-y分泌减少,抗肿瘤免疫效应下降,而INF-y分泌减少可使肿瘤细胞CXCR4表达上调。
　　局部抗肿瘤免疫效应的下降使肿瘤细胞得以实现免疫逃逸,从而增殖和进展;CXCR4表达上调可进一步促进肿瘤细胞增殖、侵袭和转移。B7-H3高表达、B7-H1高表达和TIA-1+细胞低浸润是NSCLC患者病情进展、生存期短的独立预测因素。
　　针对B7-H1和B7-H3两个负性调控分子及其相关信号途径的生物学靶向性干预,有可能成为NSCLC特异性治疗的新策略。

目录

中文摘要

Abstract

研究背景

参考文献

第一部分 B7-H1和B7-H3在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义

主要试剂与材料

方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 B7-H1和B7-H3在非小细胞肺癌免疫逃逸中作用

主要试剂与材料

方法

结果

讨论

参考文献

结论

综述

参考文献

攻读博士学位期间发表的文章

攻读学位期间获得的基金资助

缩写词表

致谢