羊膜间充质细胞在Aβ激活的小胶质细胞诱导神经元凋亡中的免疫调控作用

摘要

研究背景：
　　阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)俗称老年性痴呆(senile dementia),是老年人中常见的一种中枢神经系统(central nervous system,CNS)退行性疾病。其病因复杂,多数研究表明β-淀粉样蛋白(beta-amyloid protein,Aβ)在阿尔茨海默病(AD)中起着重要作用,Aβ作为慢性刺激物质在脑内逐渐沉积形成神经炎斑。它可以介导小胶质细胞(microglia,MI)的非特异性局灶性炎性反应,并以此导致神经元损伤或死亡。可见,Aβ沉积介导的小胶质细胞的激活是导致AD脑内神经元丢失的重要原因。
　　由于AD发病机制复杂,使其在治疗方面存在极大的困难,很多治疗AD的化学药物仅仅能改变疾病的症状,却不能抑制疾病的进展。随着高新技术的发展和应用,尤其是干细胞移植技术的不断完善,给治疗AD提供了新的策略和契机。
　　研究发现来源于胎膜的羊膜间充质细胞(Amniotic mesenchyme(stem) cells, AMSCs)不仅具有干细胞特性、免疫原性较弱,本身还具有免疫调节特性,能够抑制免疫细胞的增殖而不引起其免疫反应。基于MI在AD中的作用,我们设想羊膜间充质细胞也可抑制中枢神经系统免疫细胞-MI的过度活化,进而调控由其触发的一系列炎症级联反应的发生,从而起到保护神经元细胞的作用。
　　目的：
　　本实验旨在研究羊膜间充质细胞的干细胞特性及其对Aβ激活的小胶质细胞的免疫抑制作用,并进一步探讨Aβ激活的小胶质细胞经羊膜间充质细胞免疫调控后对体外培养的神经元细胞凋亡的影响。
　　方法：
　　1.3种细胞的原代培养及鉴定:
　　采用原代细胞培养技术,进行羊膜间充质细胞、小胶质细胞和神经元细胞的分离及培养;然后用免疫荧光标记、流式细胞仪检测分析其表型和神经生物学特性。
　　2.AMSCs与MI共培养体系的建立:
　　羊膜间充质细胞与小胶质细胞均调整浓度为1.0×106/ml,实验中处理组加入10μM Aβ1-42。具体分组:
　　(1)空白组:仅接种MI;
　　(2)Aβ激活组:接种MI+Aβ1-42;
　　(3)共培养组:接种AMSCs+MI+Aβ1-42。
　　96h后观察细胞的形态,并用ELISA检测各组炎性因子TNF-α、IL-6和NO的含量变化。
　　3.Transwell分层共培养体系的建立:
　　上室Transwell小室接种小胶质细胞,下室6孔塑料培养板培养神经元细胞,实验中处理组加入10μM Aβ1-42。实验分组如下:
　　(1)空白对照组(control组):神经元细胞正常培养于下室,上室加培养基;
　　(2)Aβ刺激组(神经元细胞+Aβ1-42):神经元细胞培养于下室,上室加入终浓度为10μM Aβ1-42的培养基;
　　(3)MI刺激组(神经元细胞+MI):神经元细胞与小胶质细胞以1:1的浓度比依次接种于下室和上室;
　　(4)Aβ与MI共刺激组(神经元细胞+Aβ1-42+MI):神经元细胞与小胶质细胞以1:1的浓度比依次接种于下室和上室,上层小胶质细胞贴壁后加入终浓度为10μM Aβ1-42的培养基。
　　(5)AMSCs干预共培养组(神经元细胞+Aβ1-42+MI+AMSCs):神经元细胞与小胶质细胞以1:1的浓度比依次接种于下室和上室,同时小胶质细胞层加入同等数量的羊膜间充质细胞,两种细胞贴壁后再加入终浓度为10μMAβ1-42的培养基。
　　4.各组细胞经处理96h之后(4、5组从加入Aβ后计时),免疫荧光显微镜检测神经元的凋亡率:1、用Hoechst33342标记法于免疫荧光显微镜下观察各组神经元的凋亡情况;2、AnnexinV-FITC/PI法检测:在高倍荧光显微镜下随机选取10个视野,计数凋亡阳性细胞的个数,计算凋亡率=凋亡阳性细胞个数/总细胞个数。
　　5.统计学处理:所有统计分析均用SPSS16.0统计软件分析,P<0.05表示差异具有统计学意义。
　　结果：
　　1.原代培养的AMSCs接种后贴壁生长,流式细胞仪鉴定为高表达CD90、CD105,低表达CD45、HLA-DR,免疫荧光染色示CD200表达阳性;经诱导后的AMSCs表达神经细胞特异性标记物MAP-2、GFAP;
　　2.分离培养的MI纯化后胞体扁平或卵圆形,突起细长。经CD68免疫荧光检测,阳性率在92％以上;
　　3.原代培养的神经元细胞胞体丰满,突起清晰,神经细胞特异性标记物MAP-2免疫荧光鉴定可见阳性细胞胞浆及突起均着色,纯度可达到90％;
　　4.ELISA检测各组炎性因子TNF-α、IL-6和NO的含量变化:
　　(1)在Aβ的刺激下,MI分泌炎性分子TNF-α、IL-6和NO的量上升(P<0.05);
　　(2)AMSCs共培养组中炎性分子的量与Aβ激活组比较下降(P<0.05),但与空白组比较,即使与AMSCs共培养,Aβ仍使TNF-α、IL-6和NO的分泌量升高(P<0.05)。
　　5.AnnexinV-FITC/PI法检测神经元细胞凋亡数据显示:
　　(1)空白对照组中神经元细胞凋亡率为12.08,单纯小胶质细胞与神经元细胞共培养时凋亡率为13.25,差异不明显(P>0.05);
　　(2)单纯Aβ与神经元细胞共培养时凋亡率为19.75,与空白对照组比较,差异有显著统计学意义(P<0.01);
　　(3)Aβ与MI共刺激组与Aβ刺激组比较,可见凋亡率升高至31.46,具有统计学意义(P<0.01);
　　(4)加入AMSCs共培养后可使神经元细胞凋亡率降至20.79,虽仍高于空白对照组(P<0.01),但与Aβ与MI共刺激组比较凋亡率下降(P<0.01)。
　　结论：
　　1.AMSCs来源丰富、扩增能力强、免疫源性低,具有干细胞特性,可诱导分化成神经元样细胞;
　　2.Aβ1-42可激活MI,促使其炎性因子分泌增多,体外培养的羊膜间充质细胞与小胶质细胞共培养后可使后者致炎因子分泌下调;
　　3.Aβ1-42介导MI的活化对神经元产生凋亡作用,AMSCs可通过负性调节MI的活化发挥神经元保护作用。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

引言

第一部分 羊膜间充质细胞的分离培养及细胞生物学研究

1、材料与仪器

2、实验方法

3、结果

4、讨论

5、小结

第二部分 羊膜间充质细胞对小胶质细胞活化的调控作用

1、材料与仪器

2、实验方法

3、结果

4、讨论

5、小结

第三部分 羊膜间充质细胞通过调理小胶质细胞活性发挥对神经元的保护作用

1、材料和仪器

2、实验方法

3、结果

4、讨论

5、小结

参考文献

综述炎症反应在阿尔茨海默病发病机制中的作用研究

缩略词表

攻读学位期间公开发表的论文

致谢