人尿源干细胞来源的外泌体对1型糖尿病大鼠的肾脏保护作用及其机制研究

摘要

目的：
　　糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy, DN)是糖尿病的主要并发症，也是导致终末期肾病的主要原因。DN病理早期表现为足细胞凋亡、数量减少，引发滤过膜功能障碍，最终造成大量蛋白尿和肾功能衰竭。因此，抑制足细胞凋亡，减少蛋白尿是DN预防和治疗中的关键问题。研究已经发现干细胞对DN有良好的治疗作用，这种作用可能与干细胞的旁分泌机制有关。其中，外泌体（Exosomes）是干细胞旁分泌机制中发挥作用的有效成分。但是用干细胞来源的Exosomes治疗DN的研究罕有报道。
　　本课题通过建立1型DN大鼠模型，研究USCs来源的Exosomes（USCs-Exo）对DN肾脏损伤的保护作用，探讨其可能的机制。
　　方法：
　　①USCs及其分泌USCs-Exo的分离、培养、鉴定：采用特定培养基从人的尿液中分离USCs，通过流式细胞术鉴定其表面标记分子，并对其多向分化潜能进行鉴定。采用超高速离心法从USCs培养上清中提取USCs-Exo，透射电镜分析其形态、大小，蛋白质免疫印迹法（Western blotting)法检测特异性蛋白CD9、CD63和CD81的表达。
　　②1型糖尿病大鼠模型的建立、分组：采用链脲佐菌素腹腔注射构建1型糖尿病大鼠模型，实验分为：正常对照组(Normal),糖尿病组(Diabetes)和糖尿病USCs-Exo治疗组(Diabetes+USCs-Exo)。
　　③USCs-Exo对1型糖尿病大鼠肾脏的保护作用:每周检测各组大鼠的随机血糖，每4周检测血清肌酐、尿素氮，收集24小时尿液检测尿肌酐、尿白蛋白水平，计算尿微量白蛋白/肌酐（urinary microalbumin-to-creatinine ratio，UACR)。12周后处死大鼠，PAS染色进行肾组织病理学检查，普通光学显微镜观察肾小球系膜基质增生变化，并计算肾小球系膜面积（Mesangial area）TUNEL法染色观察肾小球细胞凋亡情况；Real time PCR法和Western blotting法检测）肾脏组织的凋亡相关Bcl-2、Bax和Caspase-3基因和蛋白的表达水平。
　　④USCs-Exo对体外高糖刺激的人足细胞（Human Podocyte, HPDC）的保护作用：USCs-Exo干预高糖培养HPDC分为——正常葡萄糖对照组（NG组）、甘露醇高渗对照组(MA组)、高糖组（HG组）、 HG+ USCs-Exo（5ug/ml,10ug/ml和50ug/ml）干预组；72小时后，采用Annexin V-FITC/PI双染后流式细胞术检测细胞的凋亡率，Western blotting法检测HPDC凋亡蛋白Caspase-3的表达, Real time PCR检测足细胞特异性分子Synaptopodin的基因相对表达量。
　　结果：
　　①从新鲜尿液中成功分离出USCs和USCs-Exo，为进一步的实验设计提供了充足可靠的原料：USCs培养5-7天后开始贴壁生长，12-16天类似成纤维细胞样的细胞呈集落生长，传代2-3次后细胞逐渐被拉长，保持均一的成纤维细胞样生长。USCs表达间充质干细胞相似的表面分子CD29、CD90、CD73、CD44,不表达CD34和HLA-DR，表明USCs符合间充质干细胞的特征，同时USCs在体外经成骨、成脂培养基的诱导培养后,USCs成功分化为成骨、成脂细胞。从P3代USCs的条件培养基中提取出USCs-Exo，经透射电镜检查USCs-Exo大小在30-120nm，囊泡样，表达进化上相对保守的蛋白CD9、CD63和CD81。
　　②USCs-Exo能改善糖尿病大鼠UACR,减少肾小球系膜增生,减少组织细胞的凋亡,改善肾脏功能,延缓DN的发生、发展：同Normal组相比，Diabetes组的大鼠尿量和UACR显著性升高（P<0.05），4周即达到DN标准；Diabetes+USCs-Exo组4周、8周、12周UACR（19.2±2.3 mg/g，26.4±2.9 mg/g，23.4±3.2 mg/g）较同时间点Diabetes组UACR（43±4.5 mg/g，55±6.0 mg/g，74.7±5.8 mg/g）明显减少，并且没有达到DN的微量白蛋白尿标准；同Normal组相比，Diabetes组肾脏病理检查示肾小球体积增大、系膜区增宽、系膜基质明显增多；肾小球内存在明显的细胞凋亡，Bcl-2的基因和蛋白表达显著降低，Bax和Caspase-3显著升高。而Diabetes+USCs-Exo治疗组的肾脏病理和凋亡相关Bcl-2、Bax、Caspase-3的改变均得到显著性改善（P<0.05）
　　③USCs-Exo能减少体外高糖导致的HPDC凋亡和损伤：同NG组相比，HG组在培养72小时后，HPDC synaptopodin表达下降,在72h的凋亡率明显升高(P<0.05)，Caspase-3表达增多(P<0.05)。与HG组相比，USCs-Exo治疗组抑制synaptopodin的表达下调,以USCs-Exo浓度依赖性的减少HPDC凋亡率(P<0.05)，并下调Caspase-3蛋白的表达(P<0.05)。
　　结论：
　　①USCs及USCs-Exo对1型糖尿病大鼠的肾脏和体外高糖损伤的HPDC具有保护作用。
　　②USCs-Exo可能是通过抑制体内外高糖引发的足细胞凋亡和损伤起到保护肾脏的作用。

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声明

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英文摘要

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前言

材料与方法

一、实验材料

二、主要实验方法

三、统计学分析

实验结果

1.USCs的形态学观察

2.USCs具有MSCs特异性分子标志和多向分化能力

3.USCs-Exo的形态特征及蛋白含量

4.USCs-Exo表达特异性蛋白

5.糖尿病模型建立和大鼠生长情况的观察

6.大鼠生化指标比较

7.大鼠肾脏病理变化

8.大鼠肾脏中TUNEL检测

9.肾脏组织的Realtime PCR检测

10.肾脏组织的Western Blotting定量检测

11.HPDC形态学观察及鉴定结果

12.USCs-Exo抵抗高糖诱导 HPDC损伤

讨论

一、人尿源干细胞来源的外泌体具有良好的应用潜力

二、USCs-Exo对1型糖尿病大鼠的肾脏功能和结构的保护作用

三、USCs-Exo抑制糖尿病大鼠肾组织细胞凋亡

四、USCs-Exo能够抑制足细胞凋亡

结论

参考文献

综述: 干细胞与糖尿病肾病相关研究进展

中英文对照缩略词表

攻读学位期间公开发表的论文

致谢