谷氨酰胺tRNA合成酶Ser70、Lys394和Tyr491对其形成氨酰tRNA合成酶复合体的影响

摘要

氨酰tRNA合成酶（Aminoacyl-tRNA synthetase,简称AARS）是蛋白质合成过程中的关键酶。氨酰tRNA合成酶的经典功能是催化特定的氨基酸连接到相应的tRNA上形成氨酰tRNA。最近研究表明，氨酰tRNA合成酶还具有如rRNA合成、细胞凋亡、翻译调控、转录调控、信号转导等功能。所以，氨酰tRNA合成酶对细胞的存活起着至关重要的作用，而且也与人类癌症发生等诸多疾病密切相关。谷氨酰胺tRNA合成酶（QRS）是氨酰tRNA合成酶成员之一，它与精氨酰tRNA合成酶（RRS）以及P43在复合体中形成亚复合体，并且与RRS和P43作用紧密与其他氨酰tRNA合成酶作用较弱。研究QRS合成酶的结构、功能及其稳定性具有十分重要的意义。
　　本实验的目的是研究谷氨酰tRNA合成酶的氨基酸位点对其形成氨酰tRNA合成酶复合体稳定性的影响。为进一步研究谷氨酰胺tRNA合成酶的功能具有重要意义。
　　本研究通过运用生物信息学的的研究方法设计了3个QRS突变位点，构建真核表达载体pIRESpuro2-Tap-QRS，并将QRS的第70位丝氨酸突变为丙氨酸，第394位赖氨酸突变为精氨酸，第491位酪氨酸突变为苯丙氨酸。将QRS野生型和突变型重组质粒转染HELA和HEK293细胞，来比较这些突变体对QRS形成复合体稳定性的影响。首先，利用免疫共沉淀的方法将QRS野生型和突变型分别从细胞裂解上清中分离出来，再将上述分离得到的目的蛋白分别上样通过SDS-PAGE分离蛋白。用Tap抗体和RRS抗体分别进行免疫印迹（Western blotting）检测。结果显示，转染野生型和QRS-Ser70突变体组免疫沉淀中QRS和RRS在蛋白质量上无明显差异，而转染突变体QRS-Lys394和QRS-Try491两组免疫沉淀中QRS和RRS在蛋白质量上比较有明显的差异。其次本实验还利用MTT检测QRS野生型和突变型重组质粒转染细胞后对细胞凋亡活性的影响，结果显示转染突变体QRS-Lys394和QRS-Tyr491重组质粒的细胞活性高于野生型重组质粒转染的细胞。最后通过激光共聚焦对转染QRS野生型和突变体的重组质粒的细胞进行亚细胞定位来进一步研究突变体对形成复合体的影响。
　　通过以上结果证明了QRS-Lys394和QRS-Tyr491位点突变可以促进QRS从复合体中的释放，而QRS-Ser70作用则不明显，这也更进一步证明C端催化区对QRS形成复合体的稳定性起着至关重要的作用。这为以后在抑制肿瘤生长方面的研究奠定了基础。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

第一章 综 述

1氨酰tRNA合成

2 氨酰tRNA合成酶复合物（Aminoacyl-tRNA synthetase complex，MSC）

3 谷氨酰胺tRNA合成酶（Glutamine tRNA Synthetase,QRS）

第二章 材料与方法

1材料与试剂

2主要仪器设备

3 实验方法

第三章 人谷氨酰胺tRNA合成酶Ser70、Lys394和Tyr491突变对形成MSC的影响

1材料与方法

2结果分析

3 讨论

第四章 谷氨酰胺tRNA合成酶突变对细胞凋亡的影响

1 材料与方法

2结果分析

3讨论

第五章 QRS Ser70、Lys394和Tyr491突变体的亚细胞定位

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第六章 总结与展望

1总结

2展望

参考文献

附录

研究生期间科研成果

致谢